પીટર સરનો દ્વારા સંપાદિત, સ્ટેનફોર્ડ યુનિવર્સિટી સ્કૂલ ઓફ મેડિસિન, સ્ટેનફોર્ડ યુનિવર્સિટી, કેલિફોર્નિયા, 25 ડિસેમ્બર, 2020 ના રોજ મંજૂર (25 ઓક્ટોબર, 2020 ના રોજ સમીક્ષા કરવામાં આવી)
અમે કોરોનાવાયરસ-ટ્રાન્સક્રિપ્શન સંકુલની પ્રતિકૃતિમાં સબ્યુનિટ્સ વચ્ચેની ક્રિયાપ્રતિક્રિયાની જાણ કરીએ છીએ, જે પ્રતિકૃતિ અને ઉત્ક્રાંતિ સંરક્ષણ માટે જરૂરી છે.અમે પુરાવા પ્રદાન કર્યા છે કે nsp12 સાથે સંકળાયેલ NiRAN ડોમેન ટ્રાન્સમાં ન્યુક્લિયોસાઇડ મોનોફોસ્ફેટ (NMP) ટ્રાન્સફરસેસ પ્રવૃત્તિ ધરાવે છે, અને તેના લક્ષ્ય તરીકે nsp9 (એક આરએનએ બંધનકર્તા પ્રોટીન) ઓળખવામાં આવે છે.NMP moiety ના સહસંયોજક જોડાણને NSP9 એમિનો ટર્મિનસમાં નિરાન એવી પ્રતિક્રિયામાં ઉત્પ્રેરિત કરે છે જે Mn2+ આયનો અને સંલગ્ન સંરક્ષિત Asn અવશેષો પર આધાર રાખે છે.એવું જાણવા મળ્યું કે NiRAN પ્રવૃત્તિ અને nsp9 NMPylation કોરોનાવાયરસ પ્રતિકૃતિ માટે જરૂરી છે.ડેટા અમને નેસ્ટેડ વાયરસ એન્ઝાઇમ માર્કરની આ પ્રવૃત્તિને પૂર્વધારણામાં અગાઉના અવલોકનો સાથે લિંક કરવાની મંજૂરી આપે છે કે આરએનએ વાયરસના વર્ગમાં આરએનએ સંશ્લેષણની શરૂઆત કાર્યાત્મક અને ઉત્ક્રાંતિ રૂપે સુસંગત છે.
નિડોવાયરેલ્સ (કોરોનાવિરિડે, આર્ટેરીઓવિરિડે અને અન્ય 12 પરિવારો) ના આરએનએ-આધારિત આરએનએ પોલિમરેઝ (આરડીઆરપીએસ) એ પોલીપ્રોટીનમાંથી મુક્ત થતા બિન-માળખાકીય પ્રોટીન (એનએસપી) માં એમિનો-ટર્મિનલ (એન-ટર્મિનલ) ડોમેન સાથે જોડાયેલ છે, જેને નિરાન કહેવાય છે. 1ab એ વાયરલ મેઈન પ્રોટીઝ (Mpro) થી બનેલું છે.અગાઉ, ધમની વાયરસ NiRAN-RdRp nsp ની પોતાની GMPylation/UMPylation પ્રવૃત્તિની જાણ કરવામાં આવી હતી, અને તેને (હાલમાં અજાણ્યા) વાયરસ અને/અથવા સેલ બાયોપોલિમરાઇઝેશન થિંગ્સમાં ન્યુક્લિયોસાઇડ મોનોફોસ્ફેટ (NMP) ના ટ્રાન્સફર માટે ક્ષણિક જનરેટ કરવાનું સૂચન કરવામાં આવ્યું હતું.અહીં, અમે બતાવીએ છીએ કે કોરોનાવાયરસ (હ્યુમન કોરોનાવાયરસ [HCoV]-229E અને ગંભીર તીવ્ર શ્વસન સિન્ડ્રોમ કોરોનાવાયરસ 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) માં Mn2+-આશ્રિત NMPylation પ્રવૃત્તિ છે, જે Mpro-મીડિયેટેડ nsp9 ની રચના દ્વારા nsp9 માંથી મેળવવામાં આવે છે. એન-ટર્મિનલ ફ્લેન્કિંગ એનએસપીએસ પ્રોટીઓલિટીકલી રીલીઝ થાય છે, ફોસ્ફોરામીડેટ એનએસપી9 ના એન-ટર્મિનલ પર પ્રાથમિક એમાઈન (N3825) સાથે બંધાયેલ છે.આ પ્રતિક્રિયામાં યુરિડિન ટ્રાઇફોસ્ફેટ પ્રાધાન્યવાળું ન્યુક્લિયોટાઇડ છે, પરંતુ એડેનોસિન ટ્રાઇફોસ્ફેટ, ગુઆનોસિન ટ્રાઇફોસ્ફેટ અને સાઇટિડિન ટ્રાઇફોસ્ફેટ પણ યોગ્ય સહ-સબસ્ટ્રેટ છે.રિકોમ્બિનન્ટ કોરોનાવાયરસ nsp9 અને nsp12 પ્રોટીન અને આનુવંશિક રીતે એન્જિનિયર્ડ HCoV-229E મ્યુટન્ટ્સનો ઉપયોગ કરીને પરિવર્તન અભ્યાસોએ NiRAN- મધ્યસ્થી nsp9 NMPylation અને કોષ સંસ્કૃતિમાં વાયરસ પ્રતિકૃતિ માટે જરૂરી અવશેષો નક્કી કર્યા.ડેટાએ NiRAN સક્રિય સાઇટ અવશેષોની આગાહીની પુષ્ટિ કરી છે અને nsp9 NMPylation અને વિટ્રોમાં વાયરસ પ્રતિકૃતિમાં nsp9 N3826 અવશેષોની મહત્વપૂર્ણ ભૂમિકા નક્કી કરી છે.આ અવશેષો સંરક્ષિત N-ટર્મિનલ NNE ટ્રિપેપ્ટાઇડ ક્રમનો ભાગ છે અને કોરોનાવાયરસ પરિવારમાં nsp9 અને તેના હોમોલોગના એકમાત્ર અવિવર્તી અવશેષો સાબિત થયા છે.આ અભ્યાસ અન્ય નેસ્ટેડ વાયરસની NMPylation પ્રવૃત્તિના કાર્યાત્મક અભ્યાસ માટે એક નક્કર પાયો પૂરો પાડે છે અને એન્ટિવાયરલ દવાઓના વિકાસ માટે સંભવિત લક્ષ્યોની દરખાસ્ત કરે છે.
નિડોવાઈરેલ્સ પોઝિટિવ-સ્ટ્રેન્ડેડ આરએનએ વાયરસ વિવિધ કરોડરજ્જુ અને અપૃષ્ઠવંશી પ્રાણીઓને ચેપ લગાડે છે (1, 2).ઓર્ડરમાં હાલમાં 14 પરિવારો (3) શામેલ છે, જેમાંથી કોરોનાવાયરસ પરિવારનો છેલ્લા 20 વર્ષોમાં વ્યાપકપણે અભ્યાસ કરવામાં આવ્યો છે.તે સમયે, ત્રણ ઝૂનોટિક કોરોનાવાયરસ પ્રાણીઓના યજમાનોમાંથી બહાર આવ્યા અને માનવોમાં ગંભીર શ્વસન ચેપના મોટા પાયે ફાટી નીકળ્યા.ગંભીર તીવ્ર ચેપી રોગોને કારણે થતા સતત રોગચાળા સહિત.રેસ્પિરેટરી સિન્ડ્રોમ કોરોનાવાયરસ 2 (SARS-CoV-2) (4âââ7).નિડોવાયરસ એક સામાન્ય જિનોમ સંગઠનને વહેંચે છે, અને મેમ્બ્રેન-બાઉન્ડ રેપ્લિકેશન-ટ્રાન્સક્રિપ્શન કોમ્પ્લેક્સ (RTC) નું સબ્યુનિટ 5-?²-ટર્મિનલ બે-તૃતીયાંશ અને વાયરસ કણના મુખ્ય માળખાકીય સબ્યુનિટમાં એન્કોડેડ છે, તેમજ કેટલાક એક્સેસરીઝ .પ્રોટીન, જીનોમના 3??² અંત ત્રીજા ભાગમાં એન્કોડેડ (1).પ્લેનેરિયન વાયરસ (મોનોવિરિડે) (8)ના એક પરિવાર સિવાય, બધા નેસ્ટેડ વાયરસ બે મોટા ઓપન રીડિંગ ફ્રેમ્સ (ORF) ORF1a અને ORF1b માં આરટીસી સબ્યુનિટ્સને એન્કોડ કરે છે, જેનો જીનોમિક આરએનએમાંથી અનુવાદ થાય છે.ORF1a પોલીપ્રોટીન (pp) 1a ને એન્કોડ કરે છે અને ORF1a અને ORF1b સંયુક્ત રીતે pp1ab ને એન્કોડ કરે છે.ORF1a દ્વારા એન્કોડ કરાયેલા મુખ્ય પ્રોટીઝ (Mpro)ની સામાન્ય ભાગીદારી સાથે, pp1a અને pp1ab બંને પ્રોટીઓલિટીક રીતે વિવિધ પ્રકારના બિન-માળખાકીય પ્રોટીન (nsps) માં પ્રક્રિયા કરવામાં આવે છે, જેને 3CLpro તરીકે પણ ઓળખવામાં આવે છે, કારણ કે તે પિકોર્નાવાયરસ (3Cpro) સાથે સમાનતા ધરાવે છે. 9).આ nsps મોટા ડાયનેમિક RTC માં એસેમ્બલ હોવાનું માનવામાં આવે છે, જેનોમિક RNA (પ્રતિકૃતિ) અને સબજેનોમિક RNA (ટ્રાન્સક્રિપ્શન) ના સમૂહને ઉત્પ્રેરિત કરે છે, અને ORF1b (10% ? ?12).
કોર આરટીસીમાં આરએનએ-આધારિત આરએનએ પોલિમરેઝ (આરડીઆરપી) (13), સુપરફેમિલી 1 હેલિકેસ (એચઈએલ1) (14, 15) અને કેટલાક આરએનએ પ્રોસેસિંગ એન્ઝાઇમ્સનો સમાવેશ થાય છે, જે મુખ્યત્વે ORF1b અને કોરોનાવાયરસ પરિવારમાં એન્કોડેડ હોય છે અને તેમાં nsp12-nsp16 હોય છે અને Arterioviridae કુટુંબમાં nsp9-nsp12 (સંદર્ભ 10ââ 12 જુઓ).RdRp અને HEL1 પક્ષીના માળાના વાયરસના બે (એક-પાંચમા) સંરક્ષિત ડોમેન્સનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે અને અન્ય આરએનએ વાયરસમાં સમાનતા ધરાવે છે.કોર પ્રતિકૃતિને અન્ય સબ્યુનિટ્સ દ્વારા મદદ કરવામાં આવી હોવાનું માનવામાં આવે છે, જેમાં pp1a ના કાર્બોક્સી-ટર્મિનલ (C-ટર્મિનલ) પ્રદેશમાંથી મુક્ત કરાયેલા કેટલાક નાના nsps, Mpro (અનુક્રમે કોરોનાવાયરસ nsp5 અને ધમની વાયરસ nsp4) ના ડાઉનસ્ટ્રીમનો સમાવેશ થાય છે.તેઓ મર્યાદિત કુટુંબ-વિશિષ્ટ સુરક્ષા અને વિવિધ પ્રવૃત્તિઓ ધરાવે છે (સંદર્ભ 10ââ12 માં સમીક્ષા કરેલ).
પ્રમાણમાં તાજેતરમાં, બધા નેસ્ટેડ વાઈરસમાં RdRp ને અડીને એમિનો ટર્મિનસ (N-ટર્મિનસ) પર અનન્ય ક્રમની લાક્ષણિક લાક્ષણિકતાઓ ધરાવતું ડોમેન જોવા મળ્યું હતું, પરંતુ અન્ય કોઈ RNA વાયરસ (16) નથી.તેના સ્થાન અને ન્યુક્લિયોટાઇડ ટ્રાન્સફરસે (ન્યુક્લિયોસાઇડ મોનોફોસ્ફેટ [NMP] ટ્રાન્સફરસે) પ્રવૃત્તિના આધારે, આ ડોમેનનું નામ નિરાન (નેસ્ટવાયરસ RdRp-સંબંધિત ન્યુક્લિયોટાઇડ ટ્રાન્સફરેજ) છે.NiRAN-RdRp નું દ્વિ-ડોમેન સંયોજન કોરોનાવિરિડે કુટુંબમાં nsp12 અને Arterioviridae કુટુંબમાં nsp9 નું નિર્માણ કરે છે, અને અન્ય નેસ્ટોવિરિડેમાં, NiRAN-RdRp વાયરલ પોલીપ્રોટીનમાંથી સ્વતંત્ર nsp તરીકે મુક્ત થવાની અપેક્ષા છે.કોરોનાવાયરસમાં, નિરાન ડોમેનમાં ?? 1/450 અવશેષો છે અને તે લિંકર પ્રદેશ (16?19) દ્વારા C-ટર્મિનલ RdRp ડોમેન સાથે જોડાયેલ છે.ઇક્વિન આર્ટેરિટિસ વાયરસ (ઇએવી) (આર્ટેરિવિરિડે) માં, રિકોમ્બિનન્ટ nsp9 Mn2+ આયન-આશ્રિત (સ્વ) UMPylation અને GMPylation પ્રવૃત્તિઓ દર્શાવે છે, જે નેસ્ટોવાયરસ, AN, BN અને CN માં ત્રણ સંરક્ષિત ક્રમ આધારો પર આધાર રાખે છે.જ્યાં N એટલે NiRAN) (16).આ હેતુઓનું એન-ટર્મિનલ ફ્લૅન્કિંગ એ ઓછું રૂઢિચુસ્ત હેતુ preAN છે.આમાંના કેટલાક અવશેષો દૂરથી સંબંધિત પ્રોટીન કિનાઝમાં પણ સાચવવામાં આવે છે, જ્યાં તેઓ ન્યુક્લિયોસાઇડ ટ્રાઇફોસ્ફેટ (NTP) બંધનકર્તા અને ઉત્પ્રેરક પ્રવૃત્તિમાં સામેલ હોવાનું દર્શાવવામાં આવ્યું છે (20, 21).આ અવલોકન સાથે સુસંગત, સ્યુડોમોનાસ સિરીંજના સ્યુડોકિનેઝ સેલોમાં કેટલાક મુખ્ય સક્રિય સાઇટ અવશેષો તાજેતરમાં પ્રકાશિત SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 સુપરકોમ્પ્લેક્સ સાથે એસેમ્બલ કરી શકાય છે.સંરક્ષિત કોરોનાવાયરસ નિરાન અવશેષો ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોસ્ટ્રક્ચરમાં સુપરઇમ્પોઝ કરવામાં આવ્યા છે.રિકોમ્બિનન્ટ પ્રોટીન (17).એવું અનુમાન કરવામાં આવે છે કે દસ્તાવેજીકૃત (સ્વ) U/GMPylation NMP ને (હાલમાં અજાણ્યા) સબસ્ટ્રેટ (16) માં સ્થાનાંતરિત કરવા માટે એક ક્ષણિક સ્થિતિ ઉત્પન્ન કરશે, અને NiRAN અને પ્રોટીન કિનેઝ (17, 19) વચ્ચે માળખાકીય સમાનતા એ પૂર્વધારણા છે. નિરાન અન્ય પ્રોટીનમાં ફેરફાર કરે છે.
નેસ્ટેડ વાઈરસ સાથે તેના અનન્ય અને અનોખા વ્યવસ્થિત જોડાણ અને RdRp થી આનુવંશિક વિભાજન સહિતની ઘણી વિશેષતાઓ, NiRAN ને નેસ્ટેડ વાયરસ માટે વાજબી કી નિયમનકારી એન્ઝાઇમ બનાવે છે, જે તેમના ઉદભવ અને ઓળખ માટે મહત્વપૂર્ણ છે.અગાઉ, જિનોમ/સબજેનોમિક અનુવાદ અથવા પ્રતિકૃતિ/ટ્રાન્સક્રિપ્શનને નિયંત્રિત કરવા માટે નિરાન સાથે સંકળાયેલા ત્રણ સંભવિત કાર્યો કહેવામાં આવતા હતા.તે સમયે ઉપલબ્ધ દુર્લભ અને અપૂર્ણ ડેટાને ધ્યાનમાં લેતા, દરેક કાર્યના તેના ફાયદા અને ગેરફાયદા છે (16).આ સંશોધનમાં, અમે બે જાતિનું પ્રતિનિધિત્વ કરતા કોરોનાવાયરસના બાયોકેમિકલ અને રિવર્સ આનુવંશિક અભ્યાસને જોડવાનું લક્ષ્ય રાખ્યું છે, અને અમારા તારણો કોરોનાવાયરસ પરિવારના કુદરતી પરિવર્તનની ઉત્ક્રાંતિની પૃષ્ઠભૂમિમાં મૂકવાનો છે, જેથી આ રહસ્યમય ક્ષેત્રની સમજ મેળવી શકાય.અમે આરટીસીમાં કુદરતી લક્ષ્યોની ઓળખ દ્વારા નિરાનની સમજમાં મોટી પ્રગતિની જાણ કરીએ છીએ, જે (ત્રણ ઉપલબ્ધ પૂર્વધારણાઓ પૈકી) નેસ્ટેડ વાયરસ આરએનએના સંશ્લેષણની શરૂઆત કરવામાં આ ડોમેનની ભૂમિકામાં ફાળો આપે છે.આ સંશોધન વાયરસ હોસ્ટ ઈન્ટરફેસ પર નિરાનની અન્ય ભૂમિકાઓ માટેની શક્યતાઓ પણ ખોલે છે.
કોરોના વાઈરસ nsp12-સંબંધિત NiRAN ડોમેનના એન્ઝાઈમેટિક ગુણધર્મોને દર્શાવવા માટે, અમે E. coli માં માનવ કોરોનાવાયરસ 229E (HCoV-229E) nsp12 ના પુનઃસંયોજિત સ્વરૂપનું ઉત્પાદન કર્યું, જેમાં C-ટર્મિનસ પર His6 ટેગ છે, અને સંયુક્ત રીતે [α32-P] સાથે પ્રોટીન MnCl2 ની હાજરીમાં NTP સાથે મળીને ઇન્ક્યુબેટ કરો, જેમ કે સામગ્રી અને પદ્ધતિઓમાં વર્ણવેલ છે.પ્રતિક્રિયા ઉત્પાદનના પૃથ્થકરણમાં nsp12 (106 kDa) સાથે સહ-સ્થળાંતર કરનાર રેડિયોલેબલ પ્રોટીનની હાજરી સૂચવવામાં આવી હતી, જે દર્શાવે છે કે કોરોનાવાયરસ nsp12 સહસંયોજક પ્રોટીન-NMP એડક્ટ્સની રચનાને ઉત્પ્રેરિત કરે છે, જે પ્રાધાન્યરૂપે યુરીડિન મોનોફોસ્ફેટ (યુએમપી) (આકૃતિ 1) સાથે રચાય છે. બી).જથ્થાત્મક વિશ્લેષણ દર્શાવે છે કે અન્ય ન્યુક્લિયોટાઇડ્સની તુલનામાં, UMP ઇન્કોર્પોરેશનની સિગ્નલની તીવ્રતા 2 થી 3 ગણી વધી છે (આકૃતિ 1C).આ ડેટા કોરોનાવાયરસ (16) ના નિરાન ડોમેનની અનુમાનિત NMP ટ્રાન્સફર પ્રવૃત્તિ સાથે સુસંગત છે, પરંતુ સૂચવે છે કે કોરોનાવાયરસ અને ધમની વાયરસના નિરાન ડોમેનની ન્યુક્લિયોટાઇડ પસંદગીઓ અલગ છે.
HCoV-229E nsp12 ની સ્વ-NMPylation પ્રવૃત્તિ.(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) 30 મિનિટ માટે 6 mM MnCl2 ની હાજરીમાં નિયુક્ત [α-32P] NTP સાથે ઉકાળવામાં આવ્યું હતું (વિગતો માટે સામગ્રી અને પદ્ધતિઓ જુઓ).પ્રતિક્રિયા ઉત્પાદનોને SDS-PAGE દ્વારા અલગ કરવામાં આવ્યા હતા અને Coomassie બ્રિલિયન્ટ બ્લુથી રંગાયેલા હતા.(બી) રેડિયોલેબલ્ડ પ્રોટીન ફોસ્ફરસ ઇમેજિંગ દ્વારા વિઝ્યુઅલાઈઝ થાય છે.nsp12-His6 અને પ્રોટીન મોલેક્યુલર માસ માર્કર (કિલોડાલ્ટનમાં) ની સ્થિતિ A અને B માં દર્શાવવામાં આવી છે. (C) કિરણોત્સર્ગી સંકેતની તીવ્રતા (મીન ± SEM) ત્રણ સ્વતંત્ર પ્રયોગો દ્વારા નક્કી કરવામાં આવી હતી.*P≤0.05.સિગ્નલ સ્ટ્રેન્થ (ટકા) UTP સાથે સંબંધિત છે.
જોકે નિરાન-સંબંધિત એન્ઝાઇમ પ્રવૃત્તિઓ સેલ કલ્ચર (16) માં EAV અને SARS-CoV ની પ્રતિકૃતિ માટે આવશ્યક હોવાનું દર્શાવવામાં આવ્યું છે, ચોક્કસ NiRAN કાર્ય અને સંભવિત લક્ષ્યો હજુ સુધી નિર્ધારિત કરવામાં આવ્યા નથી.NiRAN અને પ્રોટીન કિનાઝ જેવા ફોલ્ડ્સ (17, 22) સાથેના પ્રોટીનના પરિવાર વચ્ચે તાજેતરમાં નોંધાયેલ માળખાકીય સમાનતાએ અમને એવી ધારણાને ચકાસવા માટે પ્રોત્સાહિત કર્યા કે NiRAN અન્ય પ્રોટીનના NMPylation ને ઉત્પ્રેરિત કરે છે.અમે HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10) દ્વારા એન્કોડ કરાયેલા બિન-માળખાકીય પ્રોટીન સહિત સંભવિત હોમોલોગસ લક્ષ્યોનો સમૂહ જનરેટ કર્યો છે, જેમાં દરેકમાં C-ટર્મિનલ His6 ટેગ (SI પરિશિષ્ટ, ટેબલ S1) છે, અને nsp12 ની હાજરી અથવા ગેરહાજરીમાં આ પ્રોટીનને [α32-P] uridine triphosphate ([α32-P]UTP) વડે ઉકાળો.E. coli માં ઉત્પાદિત બોવાઇન સીરમ આલ્બુમિન અને MBP-LacZα ફ્યુઝન પ્રોટીન નિયંત્રણો તરીકે સેવા આપે છે (આકૃતિ 2A, લેન 1 થી 7).સોડિયમ ડોડેસીલ સલ્ફેટ-પોલિયાક્રિલામાઇડ જેલ ઇલેક્ટ્રોફોરેસીસ (SDS-PAGE) અને ઓટોરેડિયોગ્રાફી દ્વારા રેડિયોલેબલ્ડ પ્રોટીનનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું અને એવું જાણવા મળ્યું હતું કે nsp12 અને nsp9 ધરાવતી પ્રતિક્રિયામાં મજબૂત કિરણોત્સર્ગી સંકેત હતો.સિગ્નલની સ્થિતિ nsp9 ના પરમાણુ સમૂહને અનુરૂપ છે, જે nsp9 (આકૃતિ 2B, ટ્રેક 7) ના nsp12-મધ્યસ્થી UMPylation સૂચવે છે.અન્ય કોઈ પરીક્ષણ પ્રોટીન UMPylated હોવાનું જણાયું નથી, જેના કારણે અમને નિષ્કર્ષ પર આવ્યા કે nsp9 એ nsp12 નું ચોક્કસ સબસ્ટ્રેટ છે.આકૃતિ 1 માં બતાવેલ સ્વ-NMPylation ડેટા સાથે સુસંગત, nsp12 તમામ ચાર NMP ને nsp9 માં સ્થાનાંતરિત કરવામાં સક્ષમ છે, જો કે કાર્યક્ષમતા અલગ છે, UMP> એડેનોસિન મોનોફોસ્ફેટ (AMP)> guanosine monophosphate (GMP)> cytidine monophosphate (CMP) ચિત્ર).3 A અને B).આ પરીક્ષામાં વપરાતી શરતો હેઠળ (પ્રતિક્રિયા અને એક્સપોઝરનો સમય ટૂંકો, nsp12 ની સાંદ્રતા ઘટાડવી; સામગ્રી અને પદ્ધતિઓ), nsp12 નું સ્વ-NMPylation શોધી શકાયું નથી (આકૃતિ 2B, લેન 7 અને આકૃતિ 1B ની સરખામણી કરો), જે અસરકારક સાબિત થયું (અને બહુવિધ રાઉન્ડ) UMP ને nsp12 થી nsp9 માં ખસેડ્યું.UMP ટ્રાન્સફરસેસ પ્રવૃત્તિ માટે Mn2+ આયનોની હાજરી જરૂરી છે, આકૃતિ 3C માં બતાવ્યા પ્રમાણે, જ્યારે Mg2+ ની હાજરીમાં માત્ર ન્યૂનતમ UMP ટ્રાન્સફરસે પ્રવૃત્તિ જોવા મળી હતી, અને અન્ય બે દ્વિભાષી કેશનની હાજરીમાં કોઈ પ્રવૃત્તિ જોવા મળી નથી.સમાન ડેટા એનએમપીલેશન એસેસમાં મેળવવામાં આવ્યો હતો જેમાં સાયટીડિન ટ્રાઇફોસ્ફેટ (સીટીપી), ગુઆનોસિન ટ્રાઇફોસ્ફેટ (જીટીપી), અને એડેનોસિન ટ્રાઇફોસ્ફેટ (એટીપી) (એસઆઈ પરિશિષ્ટ, આકૃતિ S1).
nsp9 નું HCoV-229E nsp12-મધ્યસ્થી UMPylation.પ્રોટીન સબસ્ટ્રેટ્સની શ્રેણી (બોવાઇન સીરમ આલ્બુમિન, MBP-lacZα, અને ORF1a દ્વારા એન્કોડેડ C-ટર્મિનલ His6 સાથે લેબલ કરાયેલ HCoV-229E nspsની શ્રેણી)નો ઉપયોગ HCoV-229E nsp12-His6⁺ ની UMPylation પ્રવૃત્તિનું મૂલ્યાંકન કરવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો. પ્રોટીનસામગ્રી અને પદ્ધતિઓમાં વર્ણવ્યા મુજબ nsp12 ની ગેરહાજરી (A) અથવા હાજરી (B) માં 10 મિનિટ માટે [α-32P] UTP સાથે પ્રોટીનનું સેવન કરો.A અને B ની ટોચ પર, Coomassie બ્રિલિયન્ટ બ્લુથી રંગાયેલ SDS-polyacrylamide જેલ બતાવવામાં આવે છે, અને A અને B ના તળિયે, અનુરૂપ ઑટોરેડિયોગ્રામ્સ બતાવવામાં આવે છે.પ્રોટીન મોલેક્યુલર માસ માર્કરની સ્થિતિ (કિલોડાલ્ટનમાં) ડાબી બાજુએ આપેલ છે.nsp12-His6 (B, top) ની સ્થિતિ અને nsp9-His6 (B, લેન 7) સાથે nsp12-His6 ના સેવન દરમિયાન જોવા મળેલ કિરણોત્સર્ગી સંકેત પણ સૂચવવામાં આવે છે, જે સૂચવે છે કે [α-32P] UMP થી nsp9-His6 ( 12.9 kDa), જે પરીક્ષણ કરાયેલ અન્ય પ્રોટીન માટે જોવા મળ્યું ન હતું.
HCoV-229E NiRAN- મધ્યસ્થી બાયોકેમિકલ અને વાઈરોલોજિકલ લાક્ષણિકતા nsp9 NMPylation.(A અને B) પ્રતિક્રિયામાં વપરાતા ન્યુક્લિયોટાઇડ સહ-સબસ્ટ્રેટની ભૂમિકા.Nsp12-His6 અને nsp9-His6 પ્રમાણભૂત NMPylation એસેમાં વિવિધ [α-32P] NTP ની હાજરીમાં મિશ્રિત અને ઉકાળવામાં આવે છે.(A, ટોચ) Coomassie-stained nsp9-His6 SDS-PAGE દ્વારા અલગ.(A, નીચે) જેલના સમાન વિસ્તારનો ઑટોરેડિયોગ્રાફ.(B) નિયુક્ત ન્યુક્લિયોટાઇડ કોફેક્ટરની હાજરીમાં સંબંધિત પ્રવૃત્તિ (મીન ± SEM) ત્રણ સ્વતંત્ર પ્રયોગો દ્વારા નક્કી કરવામાં આવે છે.*P≤0.05.(C) મેટલ આયનોની ભૂમિકા.[α-32P] UTP અને વિવિધ ધાતુના આયનોની હાજરીમાં પ્રમાણભૂત NMPylation પરીક્ષણ બતાવવામાં આવ્યું છે, જેમાં પ્રત્યેકની સાંદ્રતા 1 mM છે.C માં, ટોચ પર, Coomassie સ્ટેઇન્ડ nsp9-His6 બતાવવામાં આવે છે, અને C માં, નીચે, અનુરૂપ ઑટોરેડિયોગ્રાફી બતાવવામાં આવે છે.લેબલ થયેલ પ્રોટીનનું કદ (કિલોડાલ્ટનમાં) A અને C ની ડાબી બાજુએ બતાવવામાં આવ્યું છે. (D) HCoV-229E nsp12-His6 નું મ્યુટન્ટ સ્વરૂપ ઉલ્લેખિત એમિનો એસિડ અવેજીમાં [α-32P]UTP માં છે, વર્ણવ્યા પ્રમાણે સામગ્રી અને પદ્ધતિઓમાં.NMPylation પ્રતિક્રિયામાં ઉત્પન્ન થયેલ રેડિયોલેબલ nsp9-His6 ફોસ્ફોરીલેશન ઇમેજિંગ (D, top) દ્વારા શોધી કાઢવામાં આવે છે.વાઇલ્ડ-ટાઇપ (wt) પ્રોટીનની સરખામણીમાં સંબંધિત પ્રવૃત્તિ D માં દર્શાવવામાં આવી છે, અને નીચે ત્રણ સ્વતંત્ર પ્રયોગમાંથી સરેરાશ (±SEM) તરીકે લેવામાં આવે છે.ફૂદડી બિન-સંરક્ષિત અવશેષોની અવેજીમાં સૂચવે છે.(E) પ્લેક એસે દ્વારા ચેપના 24 કલાક પછી મેળવેલ p1 કોષોના કલ્ચર સુપરનેટન્ટમાં વાયરસ ટાઇટર.એન્જિનિયર્ડ HCoV-229E મ્યુટન્ટના NiRAN ડોમેનમાં કોડોન અવેજીઓ સૂચવવામાં આવે છે (અવશેષ નંબરિંગ pp1ab માં તેમની સ્થિતિ પર આધારિત છે).પ્રતિકૃતિ-ઉણપ RdRp સક્રિય સાઇટ મ્યુટન્ટ nsp12_DD4823/4AA નો ઉપયોગ નિયંત્રણ તરીકે કરવામાં આવ્યો હતો.
NiRAN ની સક્રિય સાઇટની ઊંડી સમજ મેળવવા અને nsp9-વિશિષ્ટ NMP ટ્રાન્સફરસેસની પ્રવૃત્તિથી સંબંધિત અવશેષો નક્કી કરવા માટે, અમે પરિવર્તન વિશ્લેષણ કર્યું, જેમાં અમે NiRAN AN, BN અને CN મોટિફ્સમાં રૂઢિચુસ્ત અવશેષોને બદલ્યા ( 16) તે અલા છે (SI પરિશિષ્ટ, આકૃતિ S2).વધુમાં, રૂઢિચુસ્ત Arg-to-Lys અથવા Lys-to-Arg અવેજીની અસરનું મૂલ્યાંકન બે કિસ્સાઓમાં કરવામાં આવ્યું હતું.(નકારાત્મક) નિયંત્રણ તરીકે, કોરોનાવાયરસ અને અન્ય નેસ્ટેડ વાયરસના નિરાન ડોમેનમાં અથવા ઓછા સંરક્ષિત ન હોય તેવા અવશેષોને અલા સાથે બદલવામાં આવે છે. K4116A (મોટિફ preAN માં), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (મોટિફ) ને બદલીને BN) અને D4280A (CN) નોંધપાત્ર રીતે nsp12 દ્વારા nsp9 NMPylation ઘટાડે છે અથવા તો દૂર કરે છે, જ્યારે રૂઢિચુસ્ત અવેજી (R4178K) , K4116R) સાથેના પ્રોટીન તેમની પ્રવૃત્તિના 60% અને 80% જાળવી રાખે છે, જે સૂચવે છે કે તેમની સંબંધિત બાજુ પરના પ્રતિબંધોમાં છૂટછાટ સાંકળો ભૌતિક રાસાયણિક રીતે સંવેદનશીલ હોય છે (આકૃતિ 3D).E4145A, D4273A, F4281A અને D4283A અન્ય કેટલાંક સંરક્ષિત અવશેષોને બદલવું ઘણું ઓછું હાનિકારક છે, અને nsp9 UMPylation માત્ર સાધારણ ઘટાડો થાય છે.અન્ય NTPs (આકૃતિ 3D અને SI પરિશિષ્ટ, આકૃતિ S3) ને સંડોવતા nsp9 NMPylation પ્રતિક્રિયાઓમાં સમાન પરિણામો પ્રાપ્ત થયા હતા, જે પુષ્ટિ કરે છે કે ચોક્કસ એમિનો એસિડ અવેજી પર અવલોકન કરાયેલ અસરો ન્યુક્લિયોટાઇડ કો-સબસ્ટ્રેટના પ્રકારથી સ્વતંત્ર છે.આગળ, અમે કોષ સંસ્કૃતિમાં કોરોનાવાયરસની પ્રતિકૃતિ પર આ nsp12 અવેજીની સંભવિત અસરનું પરીક્ષણ કર્યું.આ માટે, અમે 5 -7 કોષોને ટ્રાન્સક્રિપ્ટ કરવા માટે રિકોમ્બિનન્ટ વેક્સિનિયા વાયરસ (23, 24) માં ક્લોન કરેલા યોગ્ય આનુવંશિક રીતે એન્જિનિયર્ડ પૂરક DNA (cDNA) નમૂનાઓનો ઉપયોગ કર્યો.આ કોષોમાં ઉત્પાદિત ચેપી વાઇરસના સંતતિનું ટાઇટ્રેશન દર્શાવે છે કે મોટાભાગના HCoV-229E NiRAN મ્યુટન્ટ્સ શક્ય નથી (આકૃતિ 3E).બિન-સધ્ધર વાયરલ મ્યુટન્ટ્સના જૂથમાં એવા વિકલ્પોનો સમાવેશ થાય છે કે જે વિટ્રો (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A) માં NMP ટ્રાન્સફરસેસ પ્રવૃત્તિને દૂર કરવા અથવા નોંધપાત્ર રીતે ઘટાડવા માટે દર્શાવવામાં આવ્યા છે, પરંતુ બે અન્ય વિકલ્પો છે (K4116R, E4145A) % અનામત?તેમની ઇન વિટ્રો NMPylation પ્રવૃત્તિ સૂચવે છે કે વધારાના નિયંત્રણો સામેલ છે.એ જ રીતે, અન્ય બે મ્યુટેશન (R4178K, F4281A) કે જેના કારણે NiRAN ની ઇન વિટ્રો NMPylation પ્રવૃત્તિમાં સાધારણ ઘટાડો થયો, તેણે જીવંત વાઇરસ ઉત્પન્ન કર્યા, જો કે, આ વાયરસે પ્રતિકૃતિ દ્વારા ટાઇટર્સ નોંધપાત્ર રીતે ઘટાડી દીધા.આકૃતિ 3D માં બતાવેલ ઇન વિટ્રો પ્રવૃત્તિ ડેટા સાથે સુસંગત, કોરોનાવાયરસ અને/અથવા અન્ય નેસ્ટેડ વાયરસ (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) માં સંરક્ષિત ન હોય તેવા અન્ય ચાર અવશેષોને બદલીને (8, 16) સધ્ધર વાયરસ ઉત્પન્ન કર્યા, સંતાન હોવા છતાં જંગલી પ્રકારના વાયરસ (આકૃતિ 3E) ની તુલનામાં સાધારણ ઘટાડો થયેલ ટાઇટર.
નિરાન-મધ્યસ્થી NMP ટ્રાન્સફરસેસ પ્રવૃત્તિ સક્રિય RdRp ડોમેન પર આધાર રાખે છે કે કેમ તે અભ્યાસ કરવા માટે, RdRp મોટિફ C માં ડાયવેલેન્ટ મેટલ આયનો (11) ના સંકલનમાં સામેલ બે સંરક્ષિત Asp અવશેષો Ala દ્વારા બદલવામાં આવ્યા હતા. પરિણામી પ્રોટીન nsp12_DD4823/4AA જાળવી રાખે છે. તેની nsp9 NMPylation પ્રવૃત્તિ, જે દર્શાવે છે કે nsp12- મધ્યસ્થી ઇન વિટ્રો nsp9 NMPylation પ્રવૃત્તિને પોલિમરેઝ પ્રવૃત્તિની જરૂર નથી (SI પરિશિષ્ટ, આકૃતિ S4).
nsp12 માટે nsp9-વિશિષ્ટ NMP ટ્રાન્સફરસે પ્રવૃત્તિ સ્થાપિત કર્યા પછી, અમે માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી (MS) દ્વારા NMP-nsp9 એડક્ટને દર્શાવવાનો પ્રયાસ કર્યો.રિકોમ્બિનન્ટ HCoV-229E nsp9 ના સંપૂર્ણ પ્રોટીન માસ સ્પેક્ટ્રમ 12,045 Da (આકૃતિ 4A) પર ટોચ દર્શાવે છે.nsp12 ના ઉમેરાથી nsp9 ની ગુણવત્તામાં કોઈ ફેરફાર થયો નથી, જે દર્શાવે છે કે nsp12 અને nsp9 ઉપયોગમાં લેવાતી શરતો (ડિનેચરેશન) (આકૃતિ 4A) હેઠળ સ્થિર સંકુલ બનાવશે નહીં.UTP અને GTP ની હાજરીમાં, અનુક્રમે nsp9 અને nsp12 ધરાવતી પ્રતિક્રિયાના સમૂહ માપન દર્શાવે છે કે UTP નો પ્રોટીન સમૂહ 306 Da અને GTP નો પ્રોટીન સમૂહ 345 Da ખસે છે, જે દર્શાવે છે કે દરેક nsp9 પરમાણુ UMP અથવા GMP સાથે જોડાય છે. (ચિત્ર 4) C અને D).એવું અનુમાન કરવામાં આવે છે કે NiRAN- મધ્યસ્થી nsp9 NMPylation માટે જરૂરી ઊર્જા NTP હાઇડ્રોલિસિસ અને પાયરોફોસ્ફેટ પ્રકાશનમાંથી આવે છે.જોકે આ પ્રતિક્રિયામાં nsp12 (એન્ઝાઇમ) કરતાં nsp9 (લક્ષ્ય) ની 10-ગણી વધુ દાઢનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો, nsp9 નું લગભગ સંપૂર્ણ NMPylation જોવા મળ્યું હતું, જે દર્શાવે છે કે nsp12 અને nsp9 વચ્ચેની ક્રિયાપ્રતિક્રિયા અલ્પજીવી છે, અને nsp12 વધુ nsp9 ને NMPylate કરી શકે છે. ઇન વિટ્રો પરમાણુ.
nsp12 અને UTP અથવા GTP ની હાજરીમાં nsp9 નું સિંગલ NMPylation.HCoV-229E nsp9 (SI પરિશિષ્ટ, કોષ્ટક S1) (AD) નું ડિકોન્વ્યુલેટેડ સંપૂર્ણ પ્રોટીન માસ સ્પેક્ટ્રમ બતાવવામાં આવ્યું છે.(A) એકલા nsp9, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 UTP ની હાજરીમાં, (D) nsp9 + nsp12-His6 GTP ની હાજરીમાં.
nsp12 દ્વારા UMPylated nsp9 અવશેષો નક્કી કરવા માટે, nsp9-UMP ને ટ્રિપ્સિન સાથે ક્લીવ કરવામાં આવ્યું હતું.પરિણામી પેપ્ટાઈડ્સ નેનો-હાઈ પરફોર્મન્સ લિક્વિડ ક્રોમેટોગ્રાફી (HPLC) દ્વારા અલગ કરવામાં આવ્યા હતા અને ટેન્ડમ માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી (MS/MS) દ્વારા ઑનલાઇન વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.બ્યોનિક સોફ્ટવેર પેકેજ (પ્રોટીન મેટ્રિક્સ) નો ઉપયોગ કરીને ડેટા વિશ્લેષણમાં એન-ટર્મિનલ એમિનો એસિડનું યુએમપીલેશન દર્શાવવામાં આવ્યું હતું.આ મેન્યુઅલી પુષ્ટિ થયેલ છે.પુરોગામી પેપ્ટાઈડના ટેન્ડમ માસ સ્પેક્ટ્રમ [UMP]NNEIMPGK (SI પરિશિષ્ટ, આકૃતિ S5A) એ 421 m/z પર એક ટુકડો જાહેર કર્યો, જે દર્શાવે છે કે UMP nsp9 ના અવશેષ 1 સાથે જોડાય છે.
nsp9 ના N-ટર્મિનસ પર, Asn ઓર્થોકોરોનાવિરીના (SI પરિશિષ્ટ, આકૃતિ S6) ના સભ્યોમાં સુરક્ષિત છે.જો કે અમે માનીએ છીએ કે N-ટર્મિનલ પ્રાથમિક એમાઈન નાઈટ્રોજન UMP માટે સૌથી વધુ સંભવિત સ્વીકારનાર છે, અમે N-ટર્મિનલ પર NMP બંધનકર્તાના વધારાના પુરાવા મેળવવાનું નક્કી કર્યું છે.આ કારણોસર, HPLC દ્વારા શુદ્ધ કરાયેલ નોન-NMPylated અને NMPylated N-ટર્મિનલ પેપ્ટાઈડ nsp9 એસીટોન અને સોડિયમ સાયનોબોરોહાઇડ્રેડની હાજરીમાં મેળવવામાં આવ્યા હતા.આ શરતો હેઠળ, માત્ર મફત પ્રાથમિક એમાઇન્સ પ્રોપીલ (25) સાથે સુધારી શકાય છે.NNEIMPGK ક્રમ સાથે N-ટર્મિનલ nsp9-પ્રાપ્ત પેપ્ટાઈડ બે પ્રાથમિક એમાઈન્સ ધરાવે છે, એક Asn ના N-ટર્મિનસ પર અને બીજું C-ટર્મિનસ ખાતે Lys ની બાજુની સાંકળ પર.તેથી, પ્રોપીલ જૂથો બંને છેડે રજૂ કરી શકાય છે.બિન-NMPylated પેપ્ટાઇડ્સના અર્કિત આયન ક્રોમેટોગ્રામ SI પરિશિષ્ટ, આકૃતિ S5B માં દર્શાવવામાં આવ્યા છે.અપેક્ષા મુજબ, N-ટર્મિનલ અને C-ટર્મિનલ (મોનો)પ્રોપીલેટેડ (SI એપેન્ડિક્સ, ફિગર S5B, અપર લેન) અને ડિપ્રોપીલેટેડ પેપ્ટાઈડ્સ (SI એપેન્ડિક્સ, ફિગર S5B, લોઅર લેન) ઓળખી શકાય છે.nsp9 ના NMPylated N-ટર્મિનલ પેપ્ટાઈડના ઉપયોગ સાથે આ પેટર્ન બદલાય છે.આ કિસ્સામાં, માત્ર સી-ટર્મિનલ પ્રોપાયલેટેડ પેપ્ટાઈડ્સ ઓળખી શકાય છે, પરંતુ એન-ટર્મિનલ પ્રોપિલેટેડ પેપ્ટાઈડ્સ અને ડિપ્રોપીલેટેડ પેપ્ટાઈડ્સ ઓળખાયા નથી (SI એપેન્ડિક્સ, ફિગર S5C), જે દર્શાવે છે કે UMP ને N-ટર્મિનલ પ્રાથમિક એમાઈનમાં સ્થાનાંતરિત કરવામાં આવ્યું છે. ફેરફારો કરવાથી જૂથ.
આગળ, અમે લક્ષ્ય-વિશિષ્ટ અવરોધોને વ્યાખ્યાયિત કરવા માટે nsp9 ના N-ટર્મિનસ પર સંરક્ષિત અવશેષોને (અલા અથવા સેર સાથે) બદલીએ છીએ અથવા કાઢી નાખીએ છીએ.અમારા MS ડેટાના આધારે દર્શાવે છે કે NiRAN એ nsp9 ના N-ટર્મિનલ અવશેષોના પ્રાથમિક એમાઈન સાથે nsp9-NMP એડક્ટ બનાવે છે, અમે અનુમાન કર્યું કે nsp9 NMPylation ને nsp9 N-ટર્મિનલને મુક્ત કરવા માટે વાયરલ માસ્ટર પ્રોટીઝ (Mpro, nsp5) ની જરૂર છે. તેના પોલીપ્રોટીન પુરોગામી.આ પૂર્વધારણાને ચકાસવા માટે, અમે E. coli માં nsp9 ધરાવતું પુરોગામી પ્રોટીન nsp7-11 બનાવ્યું અને [α-32P] UTP (સામગ્રી અને પદ્ધતિઓ) ની હાજરીમાં પ્રમાણભૂત NMPylation પરીક્ષણ કર્યું.આકૃતિ 5A (લેન 3) માં બતાવ્યા પ્રમાણે, અનકટ nsp7-11 પુરોગામી nsp12 સાથે રેડિયોલેબલ થયેલ નથી.તેનાથી વિપરીત, જો nsp7-11 ને પૂર્વવર્તીમાંથી nsp9 (અને અન્ય nsps) છોડવા માટે રિકોમ્બિનન્ટ nsp5 દ્વારા ક્લીવ કરવામાં આવે છે, તો nsp9 સાથે સ્થાનાંતરિત રેડિયોલેબલ્ડ પ્રોટીન શોધી કાઢવામાં આવે છે, જે અમારા નિષ્કર્ષની પુષ્ટિ કરે છે કે નિરાન અને N- સહસંયોજક nsp9-NMP જાહેરાતની પસંદગીયુક્ત રચના. .N-ટર્મિનલ Asn નું ટર્મિનલ પ્રાથમિક એમાઈન (pp1a/pp1ab માં પોઝિશન 3825).આ નિષ્કર્ષ nsp9 કન્સ્ટ્રક્ટનો ઉપયોગ કરીને પ્રયોગો દ્વારા પણ સમર્થિત છે, જેમાં N-ટર્મિનસ પર એક અથવા બે વધારાના અવશેષો છે.બંને કિસ્સાઓમાં, nsp9 નું NiRAN- મધ્યસ્થી UMPylation નાબૂદ કરવામાં આવ્યું હતું (SI પરિશિષ્ટ, આકૃતિ S7).આગળ, અમે nsp9 ના N-ટર્મિનલ પર 3825-NNEIMPK-3832 પેપ્ટાઇડ સિક્વન્સમાંથી કાઢી નાખવામાં આવેલા એક અથવા બે Asn અવશેષો સાથે પ્રોટીનનું ઉત્પાદન કર્યું.બંને કિસ્સાઓમાં, nsp9 UMPylation સંપૂર્ણપણે અવરોધિત કરવામાં આવ્યું હતું (આકૃતિ 5B), વધારાના પુરાવા પૂરા પાડે છે કે વાસ્તવિક nsp9 N-ટર્મિનસ NMP રીસેપ્ટર તરીકે કાર્ય કરે છે.
nsp9 ની પ્રોટીઓલિટીક પ્રક્રિયા અને nsp12-મધ્યસ્થી UMPylation માં N-ટર્મિનલ અવશેષોની ભૂમિકા.(A) nsp9 UMPylation માટે મફત nsp9 N-ટર્મિનલની જરૂર છે.Nsp7-11-His6 રિકોમ્બિનન્ટ Mpro (nsp5-His6) ની હાજરી અથવા ગેરહાજરીમાં UTP ધરાવતા NMPylation ડિટેક્શન બફરમાં 30 °C પર પૂર્વ-ઇન્ક્યુબેટેડ છે.3 કલાક પછી, સામગ્રી અને પદ્ધતિઓમાં વર્ણવ્યા મુજબ nsp12-His6 ઉમેરીને NMPylation એસે શરૂ કરો.nsp5-His6 (લેન 1) અને nsp9-His6 (લેન 2) ધરાવતી પ્રતિક્રિયાનો ઉપયોગ નિયંત્રણ તરીકે કરવામાં આવ્યો હતો.10 મિનિટ પછી, પ્રતિક્રિયા સમાપ્ત કરવામાં આવી હતી અને પ્રતિક્રિયા મિશ્રણને SDS-PAGE દ્વારા અલગ કરવામાં આવ્યું હતું.પ્રોટીન કુમાસી બ્રિલિયન્ટ બ્લુ (A, ટોચ) થી રંગાયેલું હતું.Nsp7-11-His6 પુરોગામી અને nsp5-His6 મધ્યસ્થી ક્લીવેજના પરિણામે પ્રોસેસ્ડ પ્રોડક્ટ જમણી બાજુએ બતાવવામાં આવે છે.મહેરબાની કરીને નોંધ કરો (તેમના નાના કદને કારણે) કે આ જેલમાં nsp7 અને nsp11-His6 શોધી શકાયા નથી, અને પ્રતિક્રિયા nsp5-His6 (લેન 1 અને 4; nsp5-His6 ની સ્થિતિ ઘન વર્તુળ દ્વારા સૂચવવામાં આવે છે) સાથે પૂરક છે. અથવા nsp9-His6 (લેન 2) શેષ અશુદ્ધિઓ તરીકે MBP (ખુલ્લા વર્તુળો દ્વારા સૂચવાયેલ) ની થોડી માત્રા ધરાવે છે કારણ કે તે MBP ફ્યુઝન પ્રોટીન (SI પરિશિષ્ટ, કોષ્ટક S1) તરીકે વ્યક્ત થાય છે.(B) Nsp9-His6 વેરિઅન્ટમાં એક અથવા બે N-ટર્મિનલ Asn અવશેષોનો અભાવ છે (pp1a/pp1ab માં સ્થિતિ અનુસાર અવશેષોની સંખ્યા) અને તે nsp12-His6 અને [α-32P] UTP સાથે શુદ્ધ અને ઉકાળવામાં આવે છે.B, Coomassie સાથે સ્ટેઇન્ડ SDS-PAGE ટોચ પર બતાવવામાં આવે છે, B, અનુરૂપ ઑટોરેડિયોગ્રાફ તળિયે બતાવવામાં આવે છે.પરમાણુ વજન માર્કર (કિલોડાલ્ટનમાં) ની સ્થિતિ ડાબી બાજુએ બતાવવામાં આવી છે.(C) HCoV-229E nsp9-His6 N-ટર્મિનલ સંરક્ષિત અવશેષો Ala અથવા Ser સાથે બદલવામાં આવ્યા હતા, અને nsp12-His6 મધ્યસ્થ UMPylation પ્રતિક્રિયામાં પ્રોટીનની સમાન માત્રાનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો.પ્રતિક્રિયા ઉત્પાદનોને SDS-PAGE દ્વારા અલગ કરવામાં આવ્યા હતા અને Coomassie Brilliant Blue (C, top), અને રેડિયોલેબલ્ડ nsp9-His6 ફોસ્ફોરેસેન્સ ઇમેજિંગ (C, મધ્યમ) દ્વારા શોધી કાઢવામાં આવ્યા હતા.જંગલી-પ્રકાર (wt) પ્રોટીનનો સંદર્ભ તરીકે ઉપયોગ કરીને (100% પર સેટ), સંબંધિત NMPylation પ્રવૃત્તિ (મીન ± SEM) ની ગણતરી ત્રણ સ્વતંત્ર પ્રયોગોમાંથી કરવામાં આવી હતી.(D) HCoV-229E જંગલી પ્રકારના Huh-7 કોષોથી સંક્રમિત Huh-7 કોષોના p1 સેલ કલ્ચર સુપરનેટન્ટમાં વાયરસ ટાઇટર્સ અને nsp9 માં નિયુક્ત એમિનો એસિડ અવેજી વહન કરતા મ્યુટન્ટ્સ પ્લેક એસે દ્વારા નક્કી કરવામાં આવ્યા હતા.પ્રતિકૃતિ-ઉણપ RdRp મોટિફ C ડબલ મ્યુટન્ટ DD4823/4AA નેગેટિવ કંટ્રોલ તરીકે ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો.
nsp9 (ખાસ કરીને પોઝિશન 1, 2, 3 અને 6) નું N-ટર્મિનસ ઓર્થોકોરોનાવિરીના સબફેમિલી (SI પરિશિષ્ટ, આકૃતિ S6) ના સભ્યોમાં ખૂબ જ સંરક્ષિત છે.nsp12-મધ્યસ્થી nsp9 NMPylation માં આ અવશેષોની સંભવિત ભૂમિકાનો અભ્યાસ કરવા માટે, nsp9 ના N-ટર્મિનસ પર સતત બે Asn અવશેષો Ala અથવા Ser (એકલા અથવા સંયોજનમાં) સાથે બદલવામાં આવ્યા હતા.વાઇલ્ડ-ટાઇપ nsp9 ની સરખામણીમાં, N3825 ને Ala અથવા Ser સાથે બદલવાથી nsp12-મધ્યસ્થી UMPylation (આકૃતિ 5C) માં બે ગણા કરતાં વધુ ઘટાડો થયો.અમારા નિષ્કર્ષ સાથે સુસંગત કે NMPylation N-ટર્મિનલ અવશેષોની બાજુની સાંકળને બદલે N-ટર્મિનલ પ્રાથમિક એમાઈન પર થાય છે, અમે N3825A અને N3825S ની બદલી સાથે નોંધપાત્ર શેષ NMPylation અવલોકન કર્યું.રસપ્રદ વાત એ છે કે, જો બીજા Asn ને Ala અથવા Ser દ્વારા બદલવામાં આવે છે, તો nsp9 UMPylation વધુ મજબૂત રીતે (10 થી વધુ વખત) ઘટે છે, જ્યારે Ala ની સ્થિતિ 3, 4, અને 6 પર nsp9 UMPylation (આકૃતિ 2) પર માત્ર મધ્યમ અસર કરે છે. ).5C).ATP, CTP અથવા GTP (SI પરિશિષ્ટ, આકૃતિ S8) નો ઉપયોગ કરીને સમાન પરિણામો પ્રાપ્ત થયા હતા.સામૂહિક રીતે, આ ડેટા nsp9 NMPylation માં N2826 (nsp9 માં સ્થિતિ 2) ની મુખ્ય ભૂમિકા સૂચવે છે.
nsp9 અને NMPylation ના N-ટર્મિનસ વચ્ચેના કાર્યાત્મક સહસંબંધના વધારાના પુરાવા મેળવવા માટે, અમે કોરોનાવાયરસ પરિવારના nsp9 ક્રમનું બહુવિધ અનુક્રમ સંરેખણ (MSA) કર્યું (104 અને 113 અવશેષો વચ્ચે બદલાય છે) (SI પરિશિષ્ટ, આકૃતિ S6).કુલ મળીને, વિવિધ સસ્તન પ્રાણીઓ, પક્ષીઓ અને સરિસૃપના યજમાનોને સંક્રમિત કરતા ઓર્થોકોરોનાવિરિના પેટા-કુટુંબની 5 જાતિની 47 (જાણીતી અને પુટેટિવ) પ્રજાતિઓમાં, કુલ માત્ર 8 અવશેષો અપરિવર્તનશીલ હોવાનું જણાયું હતું.અગાઉના માળખાકીય અભ્યાસો (26 ??28) દ્વારા નિર્ધારિત કર્યા મુજબ, સૌથી વધુ વ્યાપક ફેરફારો, કાઢી નાખવા અને દાખલ કરવા સહિત, nsp9 ના ગૌણ માળખાના ઘટકો વચ્ચેના ચક્રમાં જોવા મળ્યા હતા.nsp9 ના C-ટર્મિનલ ભાગના β સ્ટ્રેન્ડ અને α હેલિક્સમાં પાંચ અપરિવર્તક અવશેષો મળી આવ્યા હતા.ત્રણ અપરિવર્તનશીલ અવશેષો nsp9 ના N ટર્મિનસના NNE મોટિફની રચના કરે છે.તે બહાર આવ્યું છે કે આ ઉદ્દેશ્યનો બીજો એએસએન એ એકમાત્ર અનિવાર્ય અવશેષ છે, જે દૂરથી સંબંધિત દેડકાના કોરોનાવાયરસના અનુમાનિત nsp9 દ્વારા પણ વહેંચાયેલું છે, અને આલ્ફાલેટોવાયરસના સબફેમિલી લેટોવિરિનીમાં માઇક્રોહાઇલા લેટોવાયરસ 1 પ્રજાતિનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે.nsp9 ગૌણ માળખાના ઘટકોમાં અવશેષોનું સંરક્ષણ ફોલ્ડિંગ અથવા જાણીતા RNA બંધનકર્તા ગુણધર્મોને જાળવવા માટે માળખાકીય વિચારણાઓ દ્વારા તર્કસંગત બનાવી શકાય છે.જો કે, આ તર્ક NNE ના સંરક્ષણને લાગુ પડતો હોય તેવું લાગતું નથી, અને આ અભ્યાસ પહેલા, ટ્રિપેપ્ટાઇડ ક્રમની વિવિધતાને મર્યાદિત કરતી અવરોધોની પ્રકૃતિ સંપૂર્ણપણે અસ્પષ્ટ હતી.
કોરોનાવાયરસ પ્રતિકૃતિમાં nsp9-NMPylation અને NNE સંરક્ષણના મહત્વને નિર્ધારિત કરવા માટે, અમે HCoV-229E મ્યુટન્ટ્સનું ઉત્પાદન કર્યું છે, જે nsp9 N-ટર્મિનલ અવશેષોના સિંગલ અથવા ડબલ અવેજીઓ ધરાવે છે, જે દર્શાવે છે કે nsp9 NMPylation વિટ્રોમાં નુકસાનકારક છે.અમે શરૂ કરીએ તે પહેલાં, અમે પ્રશ્નનો જવાબ આપવાનો પ્રયાસ કરીએ છીએ કે શું આ અવેજી (nsp8|9 ક્લીવેજ સાઇટની નજીક) સી-ટર્મિનલ pp1a પ્રદેશની પ્રોટીઓલિટીક પ્રક્રિયાને અસર કરે છે.nsp9 ના N-ટર્મિનસ પર અનુરૂપ અવેજી સમાવિષ્ટ nsp7-11 પોલીપ્રોટીન રચનાઓનો સમૂહ E. coli માં બનાવવામાં આવ્યો હતો અને રિકોમ્બિનન્ટ Mpro સાથે કાપવામાં આવ્યો હતો.Mpro-મીડિયેટેડ nsp8|9 ક્લીવેજ (અથવા અન્ય) સાથે દખલ કરતા આ પ્રોટીનમાં માળખાકીય ફેરફારોને બાદ કરતાં, ચાર સાઇટ્સ (nsp9 ફ્લેન્કિંગ સાઇટ સહિત) ની પ્રોટીઓલિટીક ક્લીવેજ કોઈ પણ પરિચયિત અવેજીકરણ (SI પરિશિષ્ટ, આકૃતિ S9) દ્વારા નોંધપાત્ર રીતે પ્રભાવિત થતી નથી. વેબસાઇટ
Huh-7 કોશિકાઓ જીનોમ-લંબાઈના HCoV-229E RNA સાથે ટ્રાન્સફેક્ટ કરવામાં આવી હતી, એનએસપી9 એન ટર્મિનસ પર સંરક્ષિત NNE ટ્રિપેપ્ટાઇડ્સ (N3825, N3826, અને E3827) માં એન્કોડિંગ અલા અથવા સેર અવેજીકરણ, જે દર્શાવે છે કે મોટાભાગના પરિવર્તનો જીવલેણ છે.અમે N-ટર્મિનલ Asn (N2835A અથવા N2835S) ના Ser અથવા Ala ને બદલીને વાયરસને બચાવવામાં સક્ષમ હતા, પરંતુ NNE ક્રમ (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, અન્ય સિંગલ અને ડબલ મ્યુટેશન સાથે વાયરસને પુનઃપ્રાપ્ત કરવામાં નિષ્ફળ ગયા. NN3825/6SS) , E3827A) (આકૃતિ 5D).
આ પરિણામો સૂચવે છે કે ટીશ્યુ કલ્ચરમાં કોરોનાવાયરસની પ્રતિકૃતિ પ્રતિબંધિત છે (સમાન અથવા સમાન), શરીરમાં nsp9 NMPylation સાઇટ્સના કુદરતી પરિવર્તનને મર્યાદિત કરે છે, અને કોરોનાવાયરસના જીવન ચક્રમાં આ પ્રતિભાવની મુખ્ય ભૂમિકાને સમર્થન આપે છે.
પ્રયોગોના છેલ્લા સેટમાં, અમે SARS-CoV-2 nsp12 અને nsp9 લેબલવાળા C-ટર્મિનલ His6 અને E. coli માં nsp12 ના બે મ્યુટન્ટ સ્વરૂપો ઉત્પન્ન કર્યા.NiRAN અને RdRp ડોમેન્સમાં સક્રિય સાઇટ અવશેષો અનુક્રમે તેના બદલે Ala નો ઉપયોગ કરતા હતા (આકૃતિ 6A અને SI પરિશિષ્ટ, કોષ્ટક S2).SARS-CoV-2 nsp12 માં K4465 એ HCoV-229E (SI પરિશિષ્ટ, આકૃતિ S2) માં K4135 ને અનુરૂપ છે, જે નિરાન પ્રવૃત્તિ અને HCoV-229E પ્રતિકૃતિ (આકૃતિ 3D અને E) માટે જરૂરી હોવાનું સાબિત થયું છે.આ અવશેષો ધમની વાયરસ EAV nsp9 K94 અવશેષોને પણ અનુરૂપ છે, જે અગાઉ નિરાન સેલ્ફ-યુએમપીલેશન/સેલ્ફ-જીએમપીલેશન (16) માટે જરૂરી હોવાનું દર્શાવવામાં આવ્યું હતું.આકૃતિ 6B માં બતાવ્યા પ્રમાણે, SARS-CoV-2 nsp12 સબસ્ટ્રેટ તરીકે nsp9 નો ઉપયોગ કરીને UMP ટ્રાન્સફરસેસ પ્રવૃત્તિ ધરાવે છે, જ્યારે nsp12_K4465A સક્રિય સાઇટ મ્યુટન્ટ નિષ્ક્રિય છે.RdRp મોટિફ C ના SDD લાક્ષણિકતા ક્રમમાં ડબલ અવેજીકરણ UMP ટ્રાન્સફરસેસ પ્રવૃત્તિ (આકૃતિ 6B) ને અસર કરતું નથી, જે દર્શાવે છે કે nsp9 UMPylation માં RdRp પ્રવૃત્તિની કોઈ સીધી અસર નથી.CTP, GTP અને ATP (SI પરિશિષ્ટ, આકૃતિ S10) નો ઉપયોગ કરીને સમાન ડેટા મેળવવામાં આવ્યો હતો.સારાંશમાં, આ ડેટા સૂચવે છે કે NiRAN-મધ્યસ્થી nsp9 NMPylation ઓર્થોકોરોનાવાયરસ સબફેમિલીની વિવિધ જાતિનું પ્રતિનિધિત્વ કરતા કોરોનાવાયરસમાં રૂઢિચુસ્ત પ્રવૃત્તિ ધરાવે છે.
SARS-CoV-2 nsp12- મધ્યસ્થી NMPylation of nsp9.(A) Coomassie સ્ટેઇન્ડ SDS-polyacrylamide જેલ NMPylation ટેસ્ટમાં વપરાતું રિકોમ્બિનન્ટ પ્રોટીન દર્શાવે છે.નિયંત્રણ તરીકે, SARS-CoV-2 nsp12 ના NiRAN ડોમેન (K4465A) અને RdRp ડોમેન (DD5152/3AA) માં સક્રિય સાઇટ અવેજી સાથે મ્યુટન્ટ પ્રોટીનનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો.અવશેષ નંબરિંગ pp1ab માં સ્થાન પર આધારિત છે.(B) nsp9-His6 અને [α-32P]UTP નો ઉપયોગ કરીને nsp12-His6 (જંગલી પ્રકાર [wt] અને મ્યુટન્ટ) ના સબસ્ટ્રેટ તરીકે UMPylation શોધનો ઑટોરેડિયોગ્રાફ.લેબલવાળા પ્રોટીનનો પરમાણુ સમૂહ (કિલોડાલ્ટનમાં) ડાબી બાજુએ બતાવવામાં આવે છે.
નિરાન ડોમેન્સ સામાન્ય રીતે નિડોવાયરેલ્સ (16) માં સાચવવામાં આવે છે, જે દર્શાવે છે કે તેઓ નિડોવાયરસ પ્રતિકૃતિ માટે આવશ્યક એન્ઝાઈમેટિક પ્રતિક્રિયાઓને ઉત્પ્રેરિત કરે છે.આ અભ્યાસમાં, અમે સાબિત કરી શક્યા કે કોરોનાવાયરસનું નિરાન ડોમેન NMP (NTP માંથી જનરેટ થયેલ) ને nsp9 માં સ્થાનાંતરિત કરે છે, જે એક રહસ્યમય આરએનએ બંધનકર્તા પ્રોટીન છે જે વાયરસની પ્રતિકૃતિમાં સામેલ છે (26?? 29), તેને કુદરતી લક્ષ્ય તરીકે નક્કી કરવા અને કોરોનાવાયરસ RTC ના ભાગીદાર.
NiRAN ડોમેન ત્રણ સિક્વન્સ મોટિફ્સ (AN, BN, અને CN) શેર કરે છે, જેમાં ખૂબ જ ઓછી સંખ્યામાં અવશેષો હોય છે જે મોનોફિલેટિક પરંતુ અત્યંત ભિન્નતા ધરાવતા Nidovirales ઓર્ડર (8, 16) માં તમામ પરિવારોમાં સાચવવામાં આવે છે.તાજેતરના અધ્યયનોએ દર્શાવ્યું છે કે તેઓ માળખાકીય રીતે પ્રોટીન કિનાઝ જેવા પ્રોટીનના મોટા પ્રમાણમાં અસ્પષ્ટ કુટુંબ સાથે સંબંધિત છે, જેને મૂળરૂપે સેલઓ કુટુંબ (17, 19, 22, 30, 31) કહેવામાં આવતું હતું.SelO-સંબંધિત પ્રોટીનમાં કિનેઝ ફોલ્ડ્સ હોય છે, પરંતુ ક્લાસિકલ કિનાઝ (22, 32) માં ઘણા સંરક્ષિત સક્રિય સાઇટ અવશેષોનો અભાવ હોય છે.સક્રિય સાઇટ સાથે બંધાયેલા અને ચોક્કસ ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ દ્વારા સ્થિર થયેલા ATP અણુઓના વિપરીત અભિગમના આધારે, SelO ને અનુમાનિત કરવામાં આવ્યું હતું અને ત્યારબાદ AMP (ફોસ્ફેટને બદલે) પ્રોટીન સબસ્ટ્રેટ (22) માં સ્થાનાંતરિત કરવાની પુષ્ટિ કરવામાં આવી હતી, જ્યારે અન્ય બેક્ટેરિયલ સેલઓ જેવા પ્રોટીન YdiU છે. તાજેતરમાં Tyr અને વિવિધ પ્રોટીન સબસ્ટ્રેટ્સ (33) ના તેના અવશેષો સાથે UMP ના સહસંયોજક જોડાણને ઉત્પ્રેરિત કરવા માટે દર્શાવવામાં આવ્યું છે.
કોરોનાવાયરસ નિરાન ડોમેનના પુટેટિવ સક્રિય સાઇટ અવશેષોની આગાહીની પુષ્ટિ કરવા અને વિસ્તૃત કરવા માટે, અમે કોરોનાવાયરસ nsp12 (આકૃતિ 3D અને E અને SI પરિશિષ્ટ, આકૃતિ S3 અને કોષ્ટક) S1â પર પરિવર્તન વિશ્લેષણ કરવા માટે બાયોકેમિકલ અને રિવર્સ જિનેટિક્સ પદ્ધતિઓનો ઉપયોગ કર્યો. S4).ડેટા દર્શાવે છે કે HCoV-229E K4135, R4178 અને D4280 ને Ala સાથે બદલવાથી NTP γ-phosphate માં તેમની હાજરીને સમર્થન આપતા સેલ કલ્ચરમાં વિટ્રો NMP ટ્રાન્સફરસેસ પ્રવૃત્તિ અને વાયરસની પ્રતિકૃતિ (આકૃતિ 3D અને E અને SI પરિશિષ્ટ, આકૃતિ S3) નાબૂદ થાય છે. ( K4135, R4178) અને સક્રિય સાઇટ મેટલ આયનોનું સંકલન (D4280).K4135 (17) ની સ્થિતિને સ્થિર કરવાની આગાહી કરાયેલ પક્ષીના માળાના વાયરસની શ્રેણીમાં સંરક્ષિત ગ્લુનું E4145A અવેજી વાયરલ પ્રતિકૃતિને દૂર કરવા માટે દર્શાવવામાં આવ્યું હતું, પરંતુ આશ્ચર્યજનક રીતે, પ્રવૃત્તિને ઇન વિટ્રો NMPylation એસેમાં જાળવી રાખવામાં આવી હતી (આકૃતિ 3D અને E અને SI પરિશિષ્ટ, આકૃતિ S3 અને કોષ્ટકો S1–S4).સાલ્મોનેલા ટાઇફીમુરિયમ (E130A) (33) ના YdiU હોમોલોગમાં અનુરૂપ અવેજી દાખલ કરવામાં આવી ત્યારે સમાન અવલોકન કરવામાં આવ્યું હતું.એકસાથે લેવામાં આવે તો, આ ડેટા ઉત્પ્રેરક કાર્યને બદલે આ સંરક્ષિત અવશેષોના નિયમનકારી કાર્યને સમર્થન આપે છે.
HCoV-229E NiRAN ડોમેન (8) માં નેસ્ટોવાયરસની શ્રેણીમાં સંરક્ષિત Phe અવશેષો (F4281A) ને બદલવાથી વિટ્રોમાં NMPylation પ્રવૃત્તિમાં ઘટાડો થયો અને કોષ સંસ્કૃતિમાં વાયરસની પ્રતિકૃતિમાં નોંધપાત્ર ઘટાડો થયો (આકૃતિ 3D, E અને SI) પરિશિષ્ટ, આકૃતિ S3).ડેટા આ અવશેષોના મહત્વપૂર્ણ નિયમનકારી કાર્ય સાથે સુસંગત છે, જેમ કે અગાઉ બતાવેલ હોમોલોગસ DFG મોટિફ Phe અવશેષ.શાસ્ત્રીય પ્રોટીન કિનાસિસમાં, તે Mg2+ બંધનકર્તા લૂપનો ભાગ છે અને કરોડરજ્જુને એસેમ્બલ અને નિયમન કરવામાં મદદ કરે છે???અસરકારક ઉત્પ્રેરક પ્રવૃત્તિ માટે જરૂરી છે (32, 34).K4116 અવશેષો (preAN મોટિફમાં) માટે Ala અને Argને અનુક્રમે બદલીને, વાયરલ પ્રતિકૃતિને દૂર કરી અને, અપેક્ષિત તરીકે, રજૂ કરાયેલ એમિનો એસિડ સાઇડ ચેઇન (આકૃતિ 3D અને E અને SI એપેન્ડિસીસ) પર આધાર રાખીને, વિટ્રોમાં NMP ટ્રાન્સફરસેસ પ્રવૃત્તિ પર વિવિધ અસરો હતી. , આકૃતિ S3).કાર્યાત્મક માહિતી માળખાકીય માહિતી સાથે સુસંગત છે, જે દર્શાવે છે કે આ અવશેષે ATP ફોસ્ફેટ (17) સાથે ક્રિયાપ્રતિક્રિયા સ્થાપિત કરી છે.અન્ય નેસ્ટેડ વાયરસ પરિવારોના NiRAN ડોમેનમાં, HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 ની સ્થિતિ Lys, Arg અથવા His (8) દ્વારા કબજે કરવામાં આવી છે, જે દર્શાવે છે કે આ ચોક્કસ અવશેષોના કાર્યાત્મક પ્રતિબંધને હળવો કરવામાં આવ્યો છે.D4188A અને D4283A નું અવેજી એન્ઝાઇમ પ્રવૃત્તિને દૂર કરે છે અથવા મજબૂત રીતે ઘટાડે છે અને વાયરસની પ્રતિકૃતિને દૂર કરે છે (આકૃતિ 3).આ બે અવશેષો મોટાભાગના (પરંતુ તમામ નહીં) નેસ્ટેડ વાયરસ (8) માં સાચવવામાં આવે છે, જે એક મહત્વપૂર્ણ કુટુંબ-વિશિષ્ટ પરંતુ સંભવતઃ બિન-ઉત્પ્રેરક કાર્ય સૂચવે છે.અન્ય કેટલાક Lys અને Asp અવશેષો (K4113A, D4180A, D4197A અને D4273A) કે જે કોરોનાવાયરિડે અથવા અન્ય નેસ્ટિઓવિરિડે પરિવારો (8) માં સંરક્ષિત નથી તેવા અલા અવેજીઓનો ઉપયોગ નિયંત્રણ તરીકે કરવામાં આવ્યો હતો.અપેક્ષા મુજબ, એન્ઝાઇમ પ્રવૃત્તિમાં થોડો ઘટાડો અને કેટલાક કિસ્સાઓમાં વાયરલ પ્રતિકૃતિ (આકૃતિ 3 અને SI પરિશિષ્ટ, આકૃતિ S3) સાથે, આ અવેજી મોટાભાગે સહ્ય છે.એકંદરે, કોરોનાવાયરસ મ્યુટાજેનેસિસ ડેટા EAV NiRAN-RdRp (16) ના સ્વ-GMP અને રિવર્સ જિનેટિક્સ ડેટા સાથે ખૂબ સુસંગત છે, જેમાં EAV nsp9 (કોરોનાવાયરસ nsp12 ઓર્થોલોગ) અવશેષો K94 (HCoV- 229E K4135 ને અનુરૂપ), મહત્વપૂર્ણ કાર્યો કરે છે. R124 (R4178 ને અનુરૂપ), D132 (D4188 ને અનુરૂપ), D165 (D4280 ને અનુરૂપ), F166 (F4281 ને અનુરૂપ).વધુમાં, HCoV-229E મ્યુટાજેનેસિસ ડેટા અગાઉ નોંધાયેલા SARS-CoV રિવર્સ જિનેટિક્સ ડેટા (16) સાથે સુસંગત અને વિસ્તૃત છે, જે અનુરૂપ CN મોટિફ Phe-to-Ala મ્યુટન્ટ SARS-CoV_nsp12 માટે અવલોકન કરાયેલા સમાન છે. વર્ણવેલ ફેનોટાઇપ -F219A અને HCoV-229E_F4281A (આકૃતિ 3 D અને E અને SI પરિશિષ્ટ, આકૃતિ S3 અને કોષ્ટક S1-S4).
EAV ઓર્થોલોગ્સ (16) ની સરખામણીમાં, જેઓ UTP અને GTP (સ્વ-NMPylation પ્રતિક્રિયામાં) માટે સ્પષ્ટ પસંદગી ધરાવે છે, અમારો અભ્યાસ દર્શાવે છે કે કોરોનાવાયરસ નિરાન ડોમેન (HCoV-229E અને SARS-CoV-2 દ્વારા રજૂ) અસરકારક રીતે થઈ શકે છે. તમામ ચાર NMP ને સ્થાનાંતરિત કર્યા, જો કે UMP માટે થોડી પસંદગી છે (આંકડા 1 અને 3).ચોક્કસ NTP કો-સબસ્ટ્રેટની પ્રમાણમાં ઓછી વિશિષ્ટતા તાજેતરમાં નોંધાયેલ SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 સુપરકોમ્પોઝિટ સ્ટ્રક્ચર સાથે સુસંગત છે, જેમાં ADP-Mg2+ NiRAN ની સક્રિય સાઇટ સાથે જોડાય છે, પરંતુ એડિનાઇન ભાગ સાથે નહીં. ચોક્કસ ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓની રચના (17).અમારા અભ્યાસમાં, NMPylation પ્રતિક્રિયામાં ઉપયોગમાં લેવાતા ન્યુક્લિયોટાઇડનો પ્રકાર મ્યુટન્ટ પ્રોટીન (SI પરિશિષ્ટ, આકૃતિ S3) ની પ્રવૃત્તિ પર કોઈ વિભેદક અસર ધરાવતો નથી, જે દર્શાવે છે કે આમાંના કોઈપણ અવશેષો ચોક્કસ ન્યુક્લિયોબેઝના બંધન સાથે નજીકથી સંબંધિત નથી.કોરોનાવાયરસ અને ધમની વાઈરસના નિરાન ડોમેન્સમાં જોવા મળેલી વિવિધ NTP સહ-સબસ્ટ્રેટ પસંદગીઓના માળખાકીય આધાર અને સંભવિત જૈવિક મહત્વનો અભ્યાસ કરવાનું બાકી છે;તેઓ સાચા હોઈ શકે છે અથવા તેમના સંબંધિત અભ્યાસની મર્યાદાઓને કારણે હોઈ શકે છે.હાલમાં, તે નકારી શકાય નહીં કે ધમની વાયરસ નિરાન ડોમેનની સંભવિત NMPylator પ્રવૃત્તિ (અગાઉની સ્વ-એનએમપીલેશન પ્રવૃત્તિની તુલનામાં) એક અલગ સહ-સબસ્ટ્રેટ પસંદગી ધરાવે છે, તે ધ્યાનમાં લેતા કે ધમની અને કોરોનાવાયરસ વચ્ચે સમાનતા છે. NiRAN ડોમેન તેની મર્યાદા પર છે.ક્રમ આધારિત સરખામણી (16).સ્યુડોકિનેઝ સેલઓ, જે કોફેક્ટર તરીકે Mg2+ નો ઉપયોગ કરે છે તેની તુલનામાં, કોરોનાવાયરસ અને ધમની વાયરસ નિરાનની પ્રવૃત્તિ Mn2+ (16) (આકૃતિ 3C અને SI પરિશિષ્ટ, આકૃતિ S1) પર આધારિત છે.Mn2+ અવલંબન અને UTP માટેની સ્પષ્ટ પસંદગી એ પ્રોટીન NMPylators ની અસામાન્ય વિશેષતા છે, અને તાજેતરમાં જ સાલ્મોનેલા ટાઇફિમ્યુરિયમના YdiU પ્રોટીનમાં પુષ્ટિ મળી છે, જે કોષોને સ્ટ્રેસ ઇન્ડક્શન સેલ એટીપી પૂલથી બચાવવા માટે સખત Mn2+-આશ્રિત પ્રોટીન ચેપરોન UMPylation ને ઉત્પ્રેરિત કરે છે. 33).
કોરોનાવાયરસ NiRAN ડોમેન અને સેલ્યુલર પ્રોટીન કિનાસેસ (17, 19) વચ્ચે તાજેતરમાં વર્ણવેલ માળખાકીય સમાનતા, NMP ને સહસંયોજક રીતે અન્ય પ્રોટીન સાથે લિંક કરવાની NiRAN ની ક્ષમતા માટે વધારાનો આધાર પૂરો પાડે છે જે અમે આ અભ્યાસમાં નોંધ્યા છે.અમે HCoV-229E ORF1a દ્વારા એન્કોડેડ પ્રોટીન પર સંભવિત નિરાન લક્ષ્યો માટે અમારી શોધ પર ધ્યાન કેન્દ્રિત કર્યું, જે RTC ના ORF1b-એનકોડેડ પ્રતિકૃતિ (12, 35) ને પ્રત્યક્ષ કે પરોક્ષ રીતે મદદ કરવા માટે જાણીતા છે.અમારા પ્રયોગો nsp9 (આકૃતિ 2) ના અસરકારક અને ચોક્કસ NMPylation માટે નિર્ણાયક પુરાવા પ્રદાન કરે છે.જો એન્ઝાઇમ (nsp12) કરતા 8 થી 10 ગણા વધારે દાઢમાં લક્ષ્ય પ્રોટીનનો ઉપયોગ કરવામાં આવે, તો તે પુષ્ટિ થાય છે કે nsp9 સંપૂર્ણપણે (મોનો) NMPકૃત છે (આકૃતિ 4).અમે તારણ કાઢ્યું છે કે nsp12 અને nsp9 વચ્ચેની ક્રિયાપ્રતિક્રિયા અલ્પજીવી છે અને nsp9 (અન્ય RTC સબ્યુનિટ્સની ગેરહાજરીમાં) સાથે સ્થિર સંકુલ બનાવશે નહીં.આ નિષ્કર્ષ SARS-CoV પ્રોટીઓમ (35) પર પ્રોટીન ક્રિયાપ્રતિક્રિયા અભ્યાસ દ્વારા સમર્થિત છે.MS પૃથ્થકરણે nsp9 ના N-ટર્મિનલ અવશેષોના પ્રાથમિક અમીનને NMPylation સાઇટ (SI પરિશિષ્ટ, આકૃતિ S5) તરીકે ઓળખી કાઢ્યું હતું.ફોસ્ફોરામિડેટ બોન્ડ અને એન-ટર્મિનલ એમિનો ગ્રૂપની રચના નિરાન-મધ્યસ્થી NMPylation પ્રવૃત્તિને સ્યુડોમોનાસ સિરીંજ સેલો-મધ્યસ્થી એએમપીલેશન પ્રતિક્રિયાથી અલગ પાડે છે, જે Ser, Thr, અથવા Tyr અવશેષો (પેપ્ટાઈડ એડ્) ખાતે O-લિંક્ડ એએમપીની રચનાને ઉત્પ્રેરિત કરે છે. 22), અને એસ. ટાઇફિમુરિયમ YdiU ઓ-લિંક્ડ (ટાયર સાથે) અને એન-લિંક્ડ (તેના સાથે) પેપ્ટાઇડ-યુએમપી એડક્ટ્સ બનાવે છે.પ્રોટીનના સેલઓ પરિવાર પર ઉપલબ્ધ મર્યાદિત માહિતી સૂચવે છે કે આ મોટા પ્રોટીન પરિવારના સભ્યો પેપ્ટાઈડ-એનએમપી એડક્ટ્સની રચનામાં ખૂબ જ અલગ છે.આ એક રસપ્રદ અવલોકન છે જે વધુ અભ્યાસને પાત્ર છે.
આ અભ્યાસમાં મેળવેલ ડેટા અમને એવી ધારણા કરવા તરફ દોરી ગયા કે nsp9 ના NMPylation ને મફત N-ટર્મિનસની જરૂર છે.વાયરલ પ્રતિકૃતિના સંદર્ભમાં, Mpro અને pp1ab દ્વારા મધ્યસ્થી કરાયેલી પ્રતિકૃતિ પોલીપ્રોટીન pp1a માં nsp8|nsp9 પ્રોસેસિંગ સાઇટના પ્રોટીઓલિટીક ક્લીવેજ દ્વારા આ પ્રદાન કરવામાં આવશે.મોટાભાગના કોરોનાવાયરસમાં, આ ચોક્કસ સાઇટ (HCoV-229E માં VKLQ|NNEI) અને અન્ય તમામ કોરોનાવાયરસ એમપ્રો ક્લીવેજ સાઇટ્સ વચ્ચેનો તફાવત Asn છે (બીજા નાના અવશેષો, જેમ કે અલા, સેર અથવા ગ્લાય) P1â પર કબજો કરે છે???સ્થાન (36).પ્રારંભિક અભ્યાસોમાં મેળવેલ પેપ્ટાઇડ ક્લીવેજ ડેટા દર્શાવે છે કે nsp8|nsp9 સાઇટની ક્લીવેજ કાર્યક્ષમતા અન્ય સાઇટ્સ કરતા ઓછી હતી, જે દર્શાવે છે કે 1) સી-ટર્મિનલની સમયસર સંકલિત પ્રક્રિયામાં આ ચોક્કસ સાઇટની નિયમનકારી ભૂમિકા હોઈ શકે છે. pp1a પ્રદેશ, અથવા 2) a વાયરસ પ્રતિકૃતિમાં ખાસ સંરક્ષિત nsp9 N-ટર્મિનસની ભૂમિકા (37).અમારો ડેટા (આકૃતિ 5A) દર્શાવે છે કે વાસ્તવિક N-ટર્મિનલ ક્રમને વહન કરતા nsp9 નું પુનઃસંયોજક સ્વરૂપ nsp12 દ્વારા અસરકારક રીતે NMPકૃત હતું.N-ટર્મિનલ ફ્લૅન્કિંગ સિક્વન્સ પરિબળ Xa (nsp9-His6; SI પરિશિષ્ટ, કોષ્ટક S1) અથવા Mpro-મીડિયેટેડ ક્લીવેજ (nsp7-11-His6; આકૃતિ 5A અને SI પરિશિષ્ટ, કોષ્ટક S1) દ્વારા દૂર કરવામાં આવી હતી.અગત્યની રીતે, અનકટ nsp9-સમાવતી પૂર્વગામી nsp7-11-His6 એ nsp12 ના NMPylation સામે પ્રતિકાર દર્શાવ્યો હતો, જે અમારા ડેટા સાથે સુસંગત છે, જે દર્શાવે છે કે nsp9-NMP એડક્ટ N-ટર્મિનલ પ્રાથમિક એમાઈન (SI પરિશિષ્ટ, આકૃતિ S5) દ્વારા રચાય છે. .NiRAN સબસ્ટ્રેટ વિશિષ્ટતાની ઊંડી સમજ મેળવવા માટે, અમે પછી nsp9 ના નજીકના N-ટર્મિનલ અવશેષો પર ધ્યાન કેન્દ્રિત કર્યું.અન્ય પ્રોટીનની ગેરહાજરીમાં, તેઓ માળખાકીય રીતે લવચીક હોય છે, જે તેમને nsp9 (26 28, 38) ના લેબલ વગરના સ્વરૂપમાં શોધવામાં આવતા અટકાવે છે, જે તેમની મર્યાદિત કુદરતી વિવિધતા દર્શાવે છે આ મહત્વપૂર્ણ ક્રમ-વિશિષ્ટ (સેકન્ડરી સ્ટ્રક્ચર સંબંધિત નથી)ને કારણે છે. nsp9 N-ટર્મિનલ ફ્રેગમેન્ટનું કાર્ય.આ પ્રદેશમાં સંરક્ષિત અવશેષોના અલા અવેજીકરણ (આકૃતિ 5C અને D અને SI પરિશિષ્ટ, આકૃતિ S8) દર્શાવે છે કે N3826 વિટ્રોમાં nsp9 NMPylation માટે આવશ્યક છે, જ્યારે N3825A અને E3827A અવેજીકરણ NMPylationમાં ઘટાડો તરફ દોરી જાય છે, જ્યારે P3820 સબસ્ટિટ્યુશન P3820 નથી. .દેખીતી રીતે nsp9 NMPylation ને અસર કરે છે.N-ટર્મિનલ Asn (N3825A, N3825S) ની અવેજીમાં nsp9 NMPylation અને કોષ સંસ્કૃતિ (આકૃતિ 5C અને D) માં વાયરસની પ્રતિકૃતિ પર માત્ર મધ્યમ અસર છે, તેમ છતાં N-ટર્મિનલ 3825-NN dipe માંથી Asn અવશેષોના ક્રમને કાઢી નાખવામાં આવે છે. સાબિત થયું કે તે વાયરસ માટે ઘાતક છે, જે દર્શાવે છે કે N-ટર્મિનસ પર બીજા અવશેષો પહેલાં એક Asn અવશેષ જરૂરી છે, પ્રાધાન્ય Asn, જો કે એવું લાગે છે કે સમાન અવશેષોની અવેજીને આંશિક રીતે સહન કરી શકાય છે (આકૃતિ 5B, C, અને D).અમે તારણ કાઢીએ છીએ કે 3825-NN ડિપેપ્ટાઇડ, ખાસ કરીને કોરોનાવાયરસ શ્રેણી (SI પરિશિષ્ટ, આકૃતિ S6) ની અંદર સંરક્ષિત અને આવશ્યક N3826 અવશેષો, NiRAN ની સક્રિય સાઇટમાં nsp9 N-ટર્મિનસનું યોગ્ય બંધન અને દિશા સુનિશ્ચિત કરે છે.
બધા પેટા-કુટુંબોના સંરક્ષિત ગ્લુ માટે અલા (E3827A) ને બદલીને વિટ્રોમાં nsp9 NMPylation જાળવી રાખે છે પરંતુ કોષ સંસ્કૃતિ (આકૃતિ 5C અને D) માં વાયરસ માટે ઘાતક છે, જે આ અવશેષના વધારાના કાર્યને સૂચવે છે, ઉદાહરણ તરીકે, મુખ્ય ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓમાં (NMPylated અથવા unmodified) ) nsp9 N-ટર્મિનસ અને વાયરસની નકલમાં સામેલ અન્ય પરિબળો.Nsp9 પરિવર્તનોએ nsp9 ની પ્રોટીઓલિટીક પ્રક્રિયાને અસર કરી નથી અથવા કોઈપણ સંલગ્ન nsps (39) (SI પરિશિષ્ટ, આકૃતિ S9), જે દર્શાવે છે કે અવલોકન કરાયેલા કેટલાંક nsp9 મ્યુટેશનના ઘાતક ફેનોટાઈપ્સ સી પ્રોટીઓલિટીક પ્રક્રિયા-ટર્મિનલ pp1a વિસ્તારના ડિસરેગ્યુલેશનને કારણે ન હતા. .
ઉપરોક્ત ડેટા પુરાવો પૂરો પાડે છે કે pp1a/pp1ab માં nsp8|9 ક્લીવેજ સાઇટની Mpro-મધ્યસ્થી સારવાર પછી, nsp9 ના N-ટર્મિનસને UMPylated (અથવા અન્ય NMP સાથે આંશિક રીતે સંશોધિત) કરી શકાય છે.વધુમાં, nsp9 ના N-ટર્મિનસનું ઉત્કૃષ્ટ સંરક્ષણ (કોરોનાવાયરસ પરિવારમાં એકવચન અને અવિવર્તી Asn અવશેષો સહિત) અને આ અભ્યાસમાં મેળવેલ વિપરીત જિનેટિક્સ ડેટા (આંકડા 3E અને 5D) અમને નિષ્કર્ષ પર દોરી ગયા કે વર્ણવેલ nsp9 NMPylation. જૈવિક રીતે સંબંધિત છે અને કોરોનાવાયરસ પ્રતિકૃતિ માટે જરૂરી છે.આ ફેરફારના કાર્યાત્મક પરિણામોનો અભ્યાસ કરવાનું બાકી છે, ઉદાહરણ તરીકે, અગાઉ વર્ણવેલ (બિન-વિશિષ્ટ) nsp9 (અસંશોધિત સ્વરૂપ) RNA બંધનકર્તા પ્રવૃત્તિ (2628) સંબંધિત.N-ટર્મિનલ NMPylation પ્રોટીન અથવા RNA સબસ્ટ્રેટ સાથે nsp9 ની ક્રિયાપ્રતિક્રિયા અથવા વિવિધ ચાર-સ્તરની એસેમ્બલીઓની રચનાને પણ અસર કરી શકે છે.આ માળખાકીય અભ્યાસોમાં અવલોકન કરવામાં આવ્યું છે અને કોરોનાવાયરસ પ્રતિકૃતિ સાથે કાર્યાત્મક રીતે સંબંધિત હોવાની પુષ્ટિ કરવામાં આવી છે, જો કે ખાસ કરીને આ ફેરફારના કિસ્સામાં (26- ââ29, 40) ની ગેરહાજરીમાં.
જોકે કોરોનાવાયરસ નિરાન ડોમેનની લક્ષ્ય વિશિષ્ટતા હજુ પણ વધુ વિગતવાર દર્શાવવાની જરૂર છે, અમારો ડેટા દર્શાવે છે કે કોરોનાવાયરસ નિરાન ડોમેનની પ્રોટીન લક્ષ્ય વિશિષ્ટતા ખૂબ જ સાંકડી છે.જો કે તમામ નિડોવાયરસ પરિવારોના નિરાન ડોમેનમાં મુખ્ય સક્રિય સાઇટ અવશેષો (8, 16) નું સંરક્ષણ આ પ્રોટીનને સંરક્ષિત NMPylator ની પ્રવૃત્તિને મજબૂતપણે સમર્થન આપે છે, આ ડોમેનના સબસ્ટ્રેટ બંધનકર્તા પોકેટ અવશેષોની ઓળખ સંરક્ષણ અને સંરક્ષણની લાક્ષણિકતા છે. , અને Nidovirales હેતુઓના વિવિધ પરિવારો વચ્ચે અલગ-અલગ હોઈ શકે છે.એ જ રીતે, અન્ય નેસ્ટેડ વાઈરસના સંબંધિત લક્ષ્યાંકો હજુ નક્કી કરવાના બાકી છે.તેઓ nsp9 અથવા અન્ય પ્રોટીનના રિમોટ ઓર્થોલોગ્સ હોઈ શકે છે, કારણ કે પાંચ પ્રતિકૃતિ ડોમેન્સ કે જે સામાન્ય રીતે નેસ્ટેડ વાઈરસમાં સંરક્ષિત હોય છે તેની બહારના સિક્વન્સ ઓછા સંરક્ષિત હોય છે (8), જેમાં Mpro અને NiRAN વચ્ચેના જીનોમ એરેનો સમાવેશ થાય છે, તેમાંથી, nsp9 એમાં સ્થિત છે. કોરોના વાઇરસ.
વધુમાં, અમે હાલમાં એવી શક્યતાને નકારી શકતા નથી કે NiRAN ડોમેનમાં વધારાના (સેલ્યુલર સહિત) લક્ષ્યો છે.આ કિસ્સામાં, તે ઉલ્લેખનીય છે કે આ ઉભરતા પ્રોટીન NMPylators (NMPylators) (30, 31) માં બેક્ટેરિયલ હોમોલોગ્સ "માસ્ટર રેગ્યુલેટર" હોવાનું જણાય છે?NMP તેમની ડાઉનસ્ટ્રીમ પ્રવૃત્તિઓને નિયંત્રિત કરવા અથવા દૂર કરવા માટે વિવિધ સેલ્યુલર પ્રોટીનને મોડ્યુલેટ કરે છે, ત્યાં વિવિધ જૈવિક પ્રક્રિયાઓમાં ભૂમિકા ભજવે છે, જેમ કે સેલ્યુલર તણાવ પ્રતિભાવ અને રેડોક્સ હોમિયોસ્ટેસિસ (22, 33).
આ અભ્યાસમાં (આંકડા 2 અને 4 અને SI પરિશિષ્ટ, આકૃતિઓ S3 અને S5), અમે સાબિત કરી શક્યા કે nsp12 એ UMP (NMP) ભાગને nsp9 માં એક જ (સંરક્ષિત) સ્થિતિમાં સ્થાનાંતરિત કર્યો, જ્યારે અન્ય પ્રોટીનમાં ફેરફાર કરવામાં આવ્યો ન હતો. વપરાયેલ શરતો હેઠળ, સારી રીતે વ્યાખ્યાયિત (છૂટકને બદલે) સબસ્ટ્રેટ વિશિષ્ટતા સપોર્ટેડ છે.આ સાથે સુસંગત, N-ટર્મિનલ nsp9 NMPylation ની સરખામણીમાં, nsp12 ની પોતાની NMPylation પ્રવૃત્તિ ખૂબ ઓછી છે, તેની તપાસ માટે લાંબા સમય સુધી ઑટોરેડિયોગ્રાફી એક્સપોઝર સમયની જરૂર છે, અને nsp12 સાંદ્રતામાં 10-ગણો વધારો વપરાય છે.વધુમાં, અમારું MS વિશ્લેષણ nsp12 ના NMPylation માટે પુરાવા પ્રદાન કરવામાં નિષ્ફળ ગયું, જે સૂચવે છે કે NiRAN ડોમેન સ્વ-NMPylation (શ્રેષ્ઠ રીતે) ગૌણ પ્રવૃત્તિ છે.જો કે, એ નોંધવું જોઇએ કે અન્ય અભ્યાસોએ પ્રાથમિક પુરાવા આપ્યા છે કે બેક્ટેરિયલ NMPylator ની સ્વ-AMPylation સ્થિતિ અન્ય પ્રોટીન સબસ્ટ્રેટ (22, 33) પર તેમની NMPylation પ્રવૃત્તિને નિયંત્રિત કરી શકે છે.તેથી, C-ટર્મિનલ RdRp ડોમેનના ફોલ્ડિંગ પર સૂચિત ચેપરોન જેવી અસર સહિત, EAV nsp9 (16) અને કોરોનાવાયરસ nsp12 (આ અભ્યાસ) માટે અહેવાલ થયેલ સ્વ-NMPylation પ્રવૃત્તિઓની સંભવિત કાર્યાત્મક અસરોની તપાસ કરવા માટે વધુ સંશોધનની જરૂર છે. 16)).
અગાઉ, નિડોવાયરલ નિરાન ડોમેનના સંભવિત ડાઉનસ્ટ્રીમ કાર્યોને લગતી કેટલીક પૂર્વધારણાઓ ધ્યાનમાં લેવામાં આવી હતી, જેમાં આરએનએ લિગેસ, આરએનએ-કેપ્ડ ગુઆનીલેટ ટ્રાન્સફરસેસ અને પ્રોટીન પ્રાઇમિંગ પ્રવૃત્તિ (16), પરંતુ તેમાંથી કોઈ પણ ઉપલબ્ધ ડાઉનસ્ટ્રીમ કાર્યો સાથે સુસંગત નથી.વધારાની ધારણાઓ કર્યા વિના નીચેની સ્થિતિઓમાં મેળવેલ માહિતી બરાબર એ જ સમયની છે.આ અભ્યાસમાં મેળવેલ ડેટા સૌથી વધુ સુસંગત છે (પરંતુ સાબિત કરી શકતો નથી) કે NiRAN ડોમેન પ્રોટીન-પ્રેરિત આરએનએ સંશ્લેષણની શરૂઆતમાં સામેલ છે.અગાઉ એવું માનવામાં આવતું હતું કે 5? માં NiRAN ડોમેનનું કાર્ય?²-આરએનએ કેપિંગ અથવા આરએનએ લિગેશન પ્રતિક્રિયાઓ આ અને અન્ય ડેટાના સમર્થનથી પ્રભાવિત થતી નથી.તેથી, ઉદાહરણ તરીકે, NiRAN ની સક્રિય સાઇટને સામાન્ય આધાર તરીકે સંરક્ષિત એએસપી સામેલ માનવામાં આવે છે (Seudomonas syringae SelO માં D252; HCoV-229E pp1ab માં D4271; SARS-CoV-2 nsp12 માં D208) (SI પરિશિષ્ટ, આકૃતિ 2 ).S2) (17, 22, 33), જ્યારે ATP-આધારિત RNA ligase અને RNA કેપિંગ એન્ઝાઇમમાં ઉત્પ્રેરક સહસંયોજક એન્ઝાઇમ-(lysyl-N)-NMP મધ્યવર્તી દ્વારા હાથ ધરવામાં આવે છે, જેમાં બિન-બદલાયેલ Lys અવશેષો સામેલ છે ( 41).વધુમાં, સંરક્ષિત પ્રોટીન લક્ષ્યો માટે કોરોનાવાયરસ NiRAN ની નોંધપાત્ર ક્રમ-આધારિત વિશિષ્ટતા અને NTP સહ-સબસ્ટ્રેટ્સ (UTP પસંદ કરે છે) માટે હળવા વિશિષ્ટતા નિરાન-મધ્યસ્થ કેપિંગ એન્ઝાઇમ અથવા RNA લિગેસ-જેવા કાર્યોનો વિરોધ કરે છે.
દેખીતી રીતે, ચકાસવા માટે ઘણા બધા વધારાના કામની જરૂર છે અને, જો સાબિત થાય, તો પ્રોટીન-પ્રેરિત આરએનએ સંશ્લેષણમાં nsp9-UMP (nsp9-NMP) ની સંભવિત ભૂમિકા વિશે વિગતવાર જણાવો, જે ઘણા રસપ્રદ પરંતુ (અત્યાર સુધી) અગાઉ નોંધાયેલા અહેવાલોને જોડશે. .અલગ અવલોકનો.ઉદાહરણ તરીકે, તે નક્કી કરવામાં આવ્યું છે કે કોરોનાવાયરસના નેગેટિવ-સ્ટ્રેન્ડ આરએનએનો અંત ઓલિગો(યુ) સ્ટ્રાન્ડ (42, 43) થી શરૂ થાય છે.આ અવલોકન એ વિચાર સાથે સુસંગત છે કે નકારાત્મક-સ્ટ્રેન્ડ આરએનએનું સંશ્લેષણ nsp9 ના UMPylated સ્વરૂપને પોલી(A) પૂંછડી (ટ્રિગર્સ) સાથે બાંધીને શરૂ કરવામાં આવે છે, જે તેના આરએનએ બંધનકર્તા દ્વારા પ્રમોટ કરવામાં આવી શકે છે પ્રવૃત્તિ અને/અથવા ક્રિયાપ્રતિક્રિયા. અન્ય RTC પ્રોટીન.nsp9 દ્વારા પૂરા પાડવામાં આવેલ UMP ભાગનો ઉપયોગ પછી nsp7/8/nsp12-મધ્યસ્થી ઓલિગોરિડીલેશન માટે "પ્રાઈમર" તરીકે ઉપયોગ કરી શકાય છે, જેનોમિક RNAમાં 3??²-પોલી(A) પૂંછડીનો ઉપયોગ કરીને અથવા અન્ય ઓલિગો (A)-સમાવતી ક્રમનો ઉપયોગ કરી શકાય છે. પિકોર્નાવાયરસ VPg પ્રોટીન (44) માટે સ્થાપિત મિકેનિઝમ જેવું જ ટેમ્પલેટ તરીકે સેવા આપે છે.જો દરખાસ્ત "બિન-માનક" હોય તો શું????(પ્રોટીન-પ્રેરિત) નેગેટિવ-સ્ટ્રેન્ડ આરએનએ સંશ્લેષણની શરૂઆત અવલોકનોની એક લિંક પૂરી પાડે છે, જે દર્શાવે છે કે કોરોનાવાયરસ નેગેટિવ-સ્ટ્રેન્ડ આરએનએ તેના છેડે UMP (UTP ને બદલે) ધરાવે છે (42), જે સૂચવે છે કે ન્યુક્લીક એસિડ ડાયસર અજાણ્યા યુરીડિન-વિશિષ્ટ એન્ડોન્યુક્લીઝ દ્વારા ફોસ્ફોરીલેટેડ છેડાને કાપી નાખે છે.જો પુષ્ટિ થાય, તો આ ન્યુક્લીક એસિડ હાઇડ્રોલિટીક પ્રવૃત્તિ nsp9 ના ઓલિગોમેરિક UMPylated સ્વરૂપને નવજાત નકારાત્મક સ્ટ્રાન્ડના 5 ² છેડામાંથી મુક્ત કરવામાં મદદ કરી શકે છે.પ્રોટીન પ્રાઇમિંગમાં nsp9 ની સંભવિત ભૂમિકા અગાઉના રિવર્સ જિનેટિક્સ અભ્યાસો સાથે પણ સુસંગત છે, જે દર્શાવે છે કે nsp9 (અને nsp8) કોરોનાવાયરસ જિનોમના 3 છેડાની નજીક સંરક્ષિત સીઆઈએસ-એક્ટિંગ RNA તત્વ સાથે વિવેચનાત્મક અને ખાસ કરીને ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરે છે.45).આ અહેવાલ મુજબ, આ અગાઉના અવલોકનો હવે ફરીથી તપાસી શકાય છે અને વધુ સંશોધન દ્વારા વિસ્તૃત કરી શકાય છે.
સારાંશમાં, અમારા ડેટાએ N-ટર્મિનસ પર RdRp સાથે જોડાયેલા પ્રોપરાઇટરી નેસ્ટેડ વાયરસ એન્ઝાઇમ ટેગની ચોક્કસ પ્રવૃત્તિ નક્કી કરી.કોરોનાવાયરસમાં, આ નવી શોધાયેલ NiRAN- મધ્યસ્થી UMPylator/NMPylator પ્રવૃત્તિનો ઉપયોગ Mn2+ અને નજીકના Asn અવશેષો પર આધાર રાખવા અને N-ટર્મિનલ પ્રાથમિક એમાઈન સાથે (ઓછી-ઊર્જા) ફોસ્ફોરામિડેટ બોન્ડ બનાવવા માટે થાય છે.nsp8|9 ક્લીવેજ સાઇટ પર Mpro-મીડિયેટેડ ક્લીવેજ દ્વારા, nsp9 લક્ષ્યનો ઉપયોગ NMPylation માટે કરી શકાય છે, જે પ્રોટીઝ અને NiRAN ડોમેન વચ્ચેના કાર્યાત્મક જોડાણને દર્શાવે છે, જે RdRp સુધી વિસ્તરે છે.nsp12 NiRAN એક્ટિવ સાઇટ અને nsp9 લક્ષ્યમાં મુખ્ય અવશેષોનું સંરક્ષણ, SARS-CoV-2 સહિત બે કોરોનાવાયરસમાંથી મેળવેલા ડેટા સાથે મળીને, મજબૂત પુરાવા પૂરા પાડે છે કે nsp9 NMPylation એ કોરોનાવાયરસ છે રૂઢિચુસ્ત લક્ષણો પણ વાયરસની નકલમાં એક મુખ્ય પગલું છે.ઉપલબ્ધ ડેટા અમને નિષ્કર્ષ પર લઈ જાય છે કે પ્રોટીન-પ્રેરિત RNA સંશ્લેષણમાં NSP9 ના NMPylated સ્વરૂપની વિશિષ્ટ ભૂમિકા કોરોનાવાયરસ અને અન્ય નેસ્ટેડ વાયરસ માટે વાજબી દૃશ્ય છે, અને NiRAN અન્ય અજાણ્યા પ્રોટીનને પણ લક્ષ્ય બનાવી શકે છે.વાયરસનું નિયમન કરો.યજમાન ક્રિયાપ્રતિક્રિયા.જો પુષ્ટિ થાય, તો વાયરલ આરએનએ સંશ્લેષણમાં પ્રોટીન પ્રાઇમર્સની સંડોવણી અગાઉ શોધાયેલ કોરોનાવાયરસ અને પિકોર્નાવાયરસ જેવા સુપરગ્રુપ (9) વચ્ચે Mpro/3CLpro અને RdRp ડોમેન્સનું અનુક્રમ આકર્ષણ વધારશે, જે હવે તાજેતરમાં સ્થાપિત પિસોનિવિરાઇટ્સમાં એકીકૃત થયા છે. 46) શ્રેણીમાં.
અમારો ડેટા એ પણ દર્શાવે છે કે આ અભ્યાસમાં ઓળખવામાં આવેલી મૂળભૂત, પસંદગીયુક્ત અને રૂઢિચુસ્ત એન્ઝાઇમ પ્રવૃત્તિઓનો ઉપયોગ એન્ટિવાયરલ દવાઓના લક્ષ્ય તરીકે થઈ શકે છે.નિરાનની સક્રિય સાઇટમાં સંરક્ષિત nsp9 N-ટર્મિનસના બંધન (અને અનુગામી ફેરફાર) માં દખલ કરતા સંયોજનો અસરકારક અને સર્વતોમુખી એન્ટિવાયરલ દવાઓ તરીકે વિકસાવી શકાય છે, જે વિવિધ (પેટા) જીનસ ચેપમાંથી પ્રાણી અને માનવ કોરોનાવાયરસની સારવાર માટે યોગ્ય છે. SARS-CoV-2 અને મિડલ ઇસ્ટ રેસ્પિરેટરી સિન્ડ્રોમ કોરોનાવાયરસ સહિત.
આ અભ્યાસમાં ઉત્પાદિત કોરોનાવાયરસ પ્રોટીનનો કોડિંગ ક્રમ RT-PCR દ્વારા HCoV-229E અથવા SARS-CoV-2 થી સંક્રમિત વેરો E6 થી સંક્રમિત Huh-7 થી અલગ RNA નો ઉપયોગ કરીને વિસ્તૃત કરવામાં આવ્યો હતો, અને પ્રમાણભૂત ક્લોનિંગ પ્રક્રિયાઓનો ઉપયોગ કરીને દાખલ કરવામાં આવ્યો હતો.pMAL-c2 (ન્યૂ ઈંગ્લેન્ડ જૈવિક પ્રયોગશાળા) અથવા PASK3-Ub-CHis6 (47) અભિવ્યક્તિ વેક્ટર (SI પરિશિષ્ટ, કોષ્ટકો S1 અને S2).PCR-આધારિત સાઇટ-નિર્દેશિત મ્યુટાજેનેસિસ (48) દ્વારા સિંગલ કોડોન અવેજીની રજૂઆત કરવામાં આવી હતી.MBP ફ્યુઝન પ્રોટીન ઉત્પન્ન કરવા માટે, E. coli TB1 કોશિકાઓ યોગ્ય pMAL-c2 પ્લાઝમિડ રચના (SI પરિશિષ્ટ, કોષ્ટક S1) સાથે રૂપાંતરિત કરવામાં આવી હતી.ફ્યુઝન પ્રોટીનને એમીલોઝ એફિનિટી ક્રોમેટોગ્રાફી દ્વારા શુદ્ધ કરવામાં આવ્યું હતું અને પરિબળ Xa સાથે ક્લીવ કરવામાં આવ્યું હતું.ત્યારપછી, C-ટર્મિનલ His6-tagged પ્રોટીનને અગાઉ વર્ણવ્યા પ્રમાણે Ni-immobilized મેટલ એફિનિટી ક્રોમેટોગ્રાફી (Ni-IMAC) દ્વારા શુદ્ધ કરવામાં આવ્યું હતું (49).ubiquitin ફ્યુઝન પ્રોટીન ઉત્પન્ન કરવા માટે, E. coli TB1 કોષોએ યોગ્ય pASK3-Ub-CHis6 પ્લાઝમિડ રચના (SI પરિશિષ્ટ, કોષ્ટકો S1 અને S2) અને pCGI પ્લાઝમિડ DNA એન્કોડિંગ ubiquitin-વિશિષ્ટ C-ટર્મિનલ હાઇડ્રોલેઝ 1 (Ubp1) નો ઉપયોગ કર્યો.પરિવર્તન (47).C-ટર્મિનલ His6-tagged કોરોનાવાયરસ પ્રોટીન અગાઉ વર્ણવ્યા પ્રમાણે શુદ્ધ કરવામાં આવ્યું હતું (50).
HCoV-229E nsp12-His6 નું સ્વ-NMPylation પરીક્ષણ EAV nsp9 (16) માં વર્ણવ્યા મુજબ કરવામાં આવ્યું હતું.ટૂંકમાં, nsp12-His6 (0.5 µM) માં 50 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)-KOH, pH 8.0, 5 mM dithiothreitol (DTT), 6 mM MnCl2, buffer, 25mm છે. ઉલ્લેખિત NTP અને 0.17 µM મેળ ખાય છે [α32-P]NTP (3,000 Ci/mmol; હાર્ટમેન એનાલિટિક) 30 મિનિટ માટે 30 °C પર.nsp12-મધ્યસ્થી nsp9 NMPylation ના અન્ય તમામ (પ્રમાણભૂત) NMPylation એસેસમાં, પ્રતિક્રિયા શરતો નીચે પ્રમાણે ગોઠવવામાં આવે છે: nsp12-His6 (0.05 µM) અને nsp9-His6 (4 µM) 50 mM HEPES-KOH (pH08) ની હાજરીમાં. ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 µM દર્શાવેલ NTP, અને 0.17 µM મેળ ખાતું [α32-P]NTP.30 ડિગ્રી સેલ્સિયસ પર 10 મિનિટ સુધી સેવન કર્યા પછી, પ્રતિક્રિયા નમૂનાને SDS-PAGE નમૂના બફર સાથે મિશ્રિત કરવામાં આવ્યો હતો: 62.5 mM tris(hydroxymethyl)aminomethane HCl (pH 6.8), 100 mM DTT, 2.5% SDS, 10% glycerol અને 0.005% brophenol. વાદળીપ્રોટીનને 5 મિનિટ માટે 90 °C પર ગરમ કરીને અને 12% SDS-PAGE દ્વારા અલગ કરવામાં આવ્યું હતું.જેલને કુમાસી બ્રિલિયન્ટ બ્લુ સોલ્યુશન (40% મિથેનોલ, 10% એસિટિક એસિડ, 0.05% કૂમાસી બ્રિલિયન્ટ બ્લુ R-250) સાથે ફિક્સ્ડ અને સ્ટેઇન્ડ કરવામાં આવે છે, તેને રંગીન કરવામાં આવે છે અને 20 કલાક માટે ફોસ્ફોરેસન્ટ ઇમેજિંગ સ્ક્રીનના સંપર્કમાં આવે છે (NMPy માંથી nsp12 શોધવા માટે) અથવા (મહત્તમ) 2 કલાક (nsp9 NMPylation આકારણી કરવા માટે).સ્ક્રીનને સ્કેન કરવા માટે ટાયફૂન 9200 ઈમેજર (જીઈ હેલ્થકેર) નો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો અને સિગ્નલની તીવ્રતાનું વિશ્લેષણ કરવા માટે ઈમેજજેનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો.
MS પૃથ્થકરણ માટે, 1 µM nsp12-His6 અને 10 µM nsp9 (હેક્ઝાહિસ્ટીડિન ટેગ વિના) નો ઉપયોગ NMPylation વિશ્લેષણ (SI પરિશિષ્ટ, કોષ્ટક S1) માં કરવામાં આવ્યો હતો અને 500 µM UTP અને GTP ની વધેલી સાંદ્રતાનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો.તેમની એકાગ્રતા અને અપેક્ષિત પ્રોટીન ગુણવત્તા પર આધાર રાખીને, MassPrep કૉલમ (વોટર્સ)થી સજ્જ વોટર્સ ACQUITY H-Class HPLC સિસ્ટમનો ઉપયોગ 1 થી 10 µL બફર પ્રોટીન સોલ્યુશનને ઓનલાઈન ડિસોલ્ટ કરવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો.બફર A (પાણી/0.05% ફોર્મિક એસિડ) અને બફર B (એસિટોનિટ્રિલ/0.045% ફોર્મિક એસિડ) ના નીચેના ગ્રેડિયન્ટ દ્વારા સિનેપ્ટ G2Si માસ સ્પેક્ટ્રોમીટર (વોટર) ના ઇલેક્ટ્રોસ્પ્રે આયન સ્ત્રોતમાં ડિસલ્ટેડ પ્રોટીન નાખવામાં આવે છે, અને સ્તંભનું તાપમાન છે. 60 ° સે અને 0.1 એમએલ/મિનિટનો પ્રવાહ દર: 2 મિનિટ માટે 5% A સાથે ઉત્સર્જન, પછી 8 મિનિટની અંદર 95% B સુધી રેખીય ઢાળ, અને બીજી 4 મિનિટ માટે 95% B જાળવી રાખો.
500 થી 5000 m/z ની સામૂહિક શ્રેણી સાથે હકારાત્મક આયનો શોધી કાઢવામાં આવે છે.ગ્લુ-ફાઈબ્રિનોપેપ્ટાઈડ B નું ઓટોમેટિક માસ ડ્રિફ્ટ કરેક્શન માટે દર 45 સેકન્ડે માપવામાં આવે છે.બેઝલાઇન અને સ્મૂથિંગને બાદ કર્યા પછી સરેરાશ સ્પેક્ટ્રમને ડીકોન્વલ્વ કરવા માટે MaxEnt1 એક્સ્ટેંશન સાથે MassLynx ઇન્સ્ટ્રુમેન્ટ સોફ્ટવેરનો ઉપયોગ કરો.
UMPylated HCoV-229E nsp9 સિક્વન્સિંગ-ગ્રેડ મોડિફાઇડ ટ્રિપ્સિન (સર્વા) ઉમેરીને પાચન કરવામાં આવ્યું હતું અને 37 °C પર રાતોરાત ઉકાળવામાં આવ્યું હતું.ક્રોમાબોન્ડ C18WP સ્પિન કૉલમ (ભાગ નંબર 730522; માચેરી-નાગેલ) નો ઉપયોગ પેપ્ટાઇડ્સને ડિસોલ્ટ કરવા અને કેન્દ્રિત કરવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો.છેલ્લે, પેપ્ટાઈડ 25 µL પાણીમાં ઓગળવામાં આવ્યું હતું, જેમાં 5% એસેટોનાઈટ્રાઈલ અને 0.1% ફોર્મિક એસિડ હતું.
ઓર્બિટ્રેપ વેલોસ પ્રો માસ સ્પેક્ટ્રોમીટર (થર્મો સાયન્ટિફિક) નો ઉપયોગ કરીને MS દ્વારા નમૂનાઓનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.અંતિમ nanoâ HPLC સિસ્ટમ (Dionex), કસ્ટમ એન્ડ-માઉન્ટેડ 50 cm થી સજ્જ??75 μm C18 RP કૉલમ 2.4 μm ચુંબકીય મણકાથી ભરપૂર છે (ડૉ. આલ્બિન મેશ હાઇ પર્ફોર્મન્સ LC GmbH) પ્રોક્સિયન નેનોસ્પ્રે સ્ત્રોત દ્વારા માસ સ્પેક્ટ્રોમીટર સાથે ઑનલાઇન જોડો;300 µm આંતરિક વ્યાસ ×??1 cm C18 PepMap પૂર્વ-એકાગ્રતા કૉલમ (થર્મો સાયન્ટિફિક).દ્રાવક તરીકે પાણી/0.05% ફોર્મિક એસિડનો ઉપયોગ કરીને, નમૂનાને 6 µL/મિનિટના પ્રવાહ દરે આપમેળે ફસાયેલો અને ડિસેલિનેટ કરવામાં આવ્યો હતો.
પાણી/0.05% ફોર્મિક એસિડ (દ્રાવક A) અને 80% એસિટોનાઇટ્રાઇલ/0.045% ફોર્મિક એસિડ (દ્રાવક B) ના નીચેના ગ્રેડિએન્ટ્સનો ઉપયોગ 300 nL/મિનિટના પ્રવાહ દરે ટ્રિપ્ટિક પેપ્ટાઇડ્સને અલગ કરવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો: 4% B માટે 5 મિનિટ, પછી મિનિટમાં 30 A રેખીય ઢાળ 45% B સુધી અને 5 મિનિટમાં 95% દ્રાવક B સુધી રેખીય વધારો.ક્રોમેટોગ્રાફિક કૉલમને સ્ટેનલેસ સ્ટીલ નેનો-એમિટર (પ્રોક્સિયન) સાથે જોડો, અને 2,300 V ની સંભવિતતાનો ઉપયોગ કરીને માસ સ્પેક્ટ્રોમીટરની ગરમ રુધિરકેશિકા પર સીધા જ ઇલ્યુએન્ટનો છંટકાવ કરો. ઓર્બિટ્રેપ માસ વિશ્લેષકમાં 60,000 ના રિઝોલ્યુશન સાથે સર્વે સ્કેન સંકળાયેલું છે. ઓછામાં ઓછા ત્રણ ડેટા MS/MS સ્કેન સાથે, 30 સેકન્ડ માટે ગતિશીલ રીતે બાકાત, રેખીય આયન ટ્રેપ અથડામણ પ્રેરિત વિયોજન અથવા ઉચ્ચ ઉર્જા અથડામણ ડિસોસિએશનનો ઉપયોગ કરીને ઓર્બિટ્રેપ શોધ સાથે , રિઝોલ્યુશન 7,500 છે.
પોસ્ટ સમય: ઓગસ્ટ-03-2021